论文部分内容阅读
研究背景：卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,具有发展迅速、恶性程度高、极易发生局部侵袭和腹腔内转移的特点,其复发率和死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶4(p21-activated kinases 4, PAK4)是最近研究比较多的在进化上保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在肿瘤细胞的增殖与侵袭中具有重要的作用。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA,通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(un-translational region,UTR)互补结合,在翻译水平上特异性抑制基因表达,参与调控生物生长和发育等多种复杂的生命过程。我们前期的研究发现miR-24-3p在上皮性卵巢癌组织中的表达量为正常卵巢组织中的20倍,且TargetScan中PAK4为miR-24-3p的直接作用靶点,因而我们展开了miR-24、PAK4与上皮性卵巢癌之间的相关性研究。本课题研究miR-24三个成熟体之一的miR-24-1-5p,拟构建miR-24-1-5p稳定过表达的上皮性卵巢癌细胞株,明确miR-24-1-5p对上皮性卵巢癌细胞增殖及迁移能力的影响,从而为探究上皮性卵巢癌发生发展的机制以及治疗方式提供一条新的途径。目的：通过完成]miR-24-1-5p干扰质粒的构建和鉴定、筛选miR-24-1-5p稳定过表达的细胞株,来进一步探究miR-24-1-5p对上皮性卵巢癌细胞在增殖、迁移等生物行为方面的影响,从而为阐明上皮性卵巢癌的发生发展机制提供实验依据。方法：1、利用BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kits试剂盒构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-24-1-5p干扰质粒并送由上海生工生物工程有限公司测序。2、利用构建成功的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-24-1-5p质粒转染上皮性卵巢癌细胞株A2780 48小时后,用流式细胞仪检测转染效率并行GFP荧光分选。3、采用有限稀释克隆的方法,通过pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-24-1-5p质粒的抗Blasticidin特性,行Blasticidin药物压力筛选。4、采用Western Blot检测上调miR-24-1-5p的表达水平对上皮性卵巢癌细胞中PAK4表达量的影响。5、采用MTS细胞增殖实验检测上调miR-24-1-5p的表达水平对上皮性卵巢癌细胞在体外的增殖活性的影响。6、采用细胞划痕试验检测上调]miR-24-1-5p的表达水平对上皮性卵巢癌细胞迁移能力的影响。7、采用体外移植瘤实验检测上调miR-24-1-5p的表达水平对上皮性卵巢癌细胞在体内的增殖活性的影响。结果：1、重组质粒测序结果表明,miR-24-1-5p序列已成功连接入质粒。2、上皮性卵巢癌细胞A2780转染miR-24-1-5p干扰质粒48h后,经流式细胞仪检测转染效率为16.0%左右,GFP荧光分选后得到表达GFP荧光蛋白的A2780细胞。3、经有限稀释克隆,并维持Blasticidin7μg/ml药物浓度2周后,得到稳定转染miR-24-1-5p干扰质粒的单克隆A2780细胞系。4、上调A2780细胞中miR-24-1-5p的表达水平后,其细胞中PAK4的表达量较阴性对照组明显降低。5、上调A2780细胞中miR-24-1-5p的表达水平后,其细胞增殖能力明显高于阴性对照组(P<0.05)。6、上调A2780细胞中miR-24-1-5p的表达水平后,其细胞的迁移能力与阴性对照组相比未见明显差异(P>0.05)。7、上调A2780细胞中miR-24-1-5p的表达水平后,其细胞在体内的增殖能力明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论：1、成功构建了pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-24-1-5p干扰质粒及稳定转染的上皮性卵巢癌细胞株。2、miR-24-1-5p在上皮性卵巢癌细胞中能抑制PAK4的表达。3、miR-24-1-5p对上皮性卵巢癌细胞在体内外的增殖能力均有促进作用。4、miR-24-1-5p对上皮性卵巢癌细胞的迁移能力没有明显影响。