【摘 要】
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目的:索拉非尼（Sorafenib）是晚期原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）患者的一线治疗药物,其抗肿瘤活性可能与该药抑制了丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）信号通路有关,虽可延
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目的:索拉非尼（Sorafenib）是晚期原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）患者的一线治疗药物,其抗肿瘤活性可能与该药抑制了丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）信号通路有关,虽可延长患者的总生存时间,但有效率较低,其治疗效果仍不理想。有研究表明,在多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）中,ERK抑制剂与替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）具有协同作用。本研究旨在探讨以索拉非尼和1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双（邻氨基苯巯基）丁二烯（（2Z,3Z）-bis{amino[（2-aminophenyl）sulfanyl]methylidene}butanedinitrile,U0126）为代表的ERK抑制剂对肝癌细胞抵抗替莫唑胺的逆转作用及其机制。方法:1.探索ERK抑制剂是否可以增加替莫唑胺对肝癌细胞的活力、凋亡和DNA损伤的影响。（1）将Hep G2、Huh7、MHCC-97H和SMCC-7721四种肝癌细胞株分为两个实验组,一组分别用TMZ和TMZ+索拉非尼处理,另一组分别用TMZ和TMZ+U0126处理,然后采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT）法检测各组中细胞的活力,并计算相应处理组对肝癌细胞的抑制率。（2）将Hep G2肝癌细胞株分成4组,分别给予二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）、U0126、TMZ和TMZ+U0126处理,然后采用Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,采用蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测DNA损伤相关蛋白p-ATR、γ-H2AX和p-ATM的表达情况,采用细胞免疫荧光检测γ-H2AX蛋白的表达情况。2.探索ERK抑制剂是否通过抑制O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O~6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）发挥逆转肝癌细胞对替莫唑胺抵抗的作用。（1）将Hep G2、Huh7、MHCC-97H和SMCC-7721四种肝癌细胞株分为两个实验组,一组分别给予TMZ和TMZ+索拉非尼处理,另一组分别给予TMZ和TMZ+U0126处理,采用WB检测MGMT蛋白表达情况。（2）将Hep G2细胞用不同浓度的U0126处理不同的时间后,用定量逆转录PCR（Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测MGMT m RNA的表达情况。（3）采用转染试剂Lipofectamine 2000转染MGMT质粒到Hep G2细胞中建立MGMT高表达瞬转细胞株（Hep G2MGMT OE）,给予TMZ和TMZ+U0126处理,然后采用MTT法检测各组中细胞的活力并计算相应处理组对肝癌细胞的抑制率,采用WB检测MGMT蛋白表达情况。结果:（1）索拉非尼和U0126可以增加TMZ抑制肝癌细胞Hep G2、Huh7、MHCC-97H和SMCC-7721的增殖能力。（2）U0126可以增加TMZ促凋亡作用以及增加TMZ诱导的Hep G2细胞中的DNA损伤。（3）索拉非尼和U0126可以抑制肝癌细胞中MGMT蛋白的表达。（4）U0126可以抑制Hep G2细胞中MGMT m RNA的表达。（5）U0126不能增加TMZ对过表达MGMT的肝癌细胞（Hep G2MGMT OE）的增殖抑制作用,且对Hep G2MGMT OE细胞中MGMT蛋白表达无抑制作用。结论:索拉非尼和U0126可以通过下调ERK活性抑制MGMT的表达,从而逆转肝癌细胞对TMZ的耐药。索拉非尼联合TMZ能否成为一种新的治疗方法值得探索。
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