病毒感染会触发宿主细胞启动抗病毒天然免疫反应。病毒感染宿主细胞后,病毒的保守成分——病原相关分子模式被宿主细胞自身遗传表达的模式识别受体所识别,激活一系列抗病毒信号转导过程,并且诱导大量下游效应分子如干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子等的表达,进而引起细胞的凋亡、抑制病毒的复制和促进适应性免疫反应的启动,最终清除入侵机体的病毒。与此同时,宿主细胞中也存在多种调节机制及时终止病毒感染诱导的I型干扰素及下游抗病毒基因的表达,避免过度免疫的发生。RNA病毒感染细胞后,释放至胞质中的病毒RNA将结合并激活胞质RNA受体RIG-I和MDA5。活化后的RIG-I和MDA5转移至线粒体并与线粒体定位的接头蛋白VISA通过各自的CARD结构域相互作用。随后,VISA进一步通过其CARD结构域形成寡聚体,并招募多个TRAF家族蛋白、激酶IKK和TBK1、以及转录因子NF-kB和IRF3等,形成VISA复合物。其中,转录因子IRF3和NF-kB分别被激酶TBK1和IKK进行磷酸化并激活,最终诱导I型干扰素和炎症因子的产生。信号转导后期,激活的VISA将被多个E3泛素连接酶进行泛素化修饰并最终发生蛋白酶体途径依赖的降解,防止信号通路的持续激活。根据文献报道,包括RIG-I、cGAS、MITA、TBK1和IRF3等在内的多个抗病毒信号转导过程中的重要分子都能够发生磷酸化修饰,并且这些磷酸化修饰对于抗病毒天然免疫反应的及时关闭都具有非常关键的调节作用。然而,接头蛋白VISA是否也存在某种磷酸化修饰抑制其蛋白活性尚未见文献报道。为了寻找潜在的可以催化VISA发生磷酸化修饰并调控VISA活性的分子,我们将多个蛋白激酶与VISA的表达克隆共同转染HEK293细胞,通过报告基因实验和生化实验鉴定出两个能够抑制VISA介导IFN-β启动子激活的候选蛋白,分别是cAMP依赖的蛋白激酶PKA的催化亚基PRKACA和PRKACB。报告基因、实时定量PCR和空斑实验结果显示,PRKACA/B以功能冗余的形式负向调控RNA病毒诱导的I型干扰素的产生和细胞抗病毒免疫反应。生化实验结果表明,PRKACA/B催化VISA的CARD结构域中第54位苏氨酸发生磷酸化修饰,VISA该位点的磷酸化修饰可以抑制VISA通过其CARD结构域形成寡聚体,从而抑制VISA的持续激活;与此同时,VISA该位点的磷酸化修饰还能够促进VISA对E3泛素连接酶MARCH5的招募,从而增强VISA第7位和第500位赖氨酸发生的K48位连接的多聚泛素化修饰,加剧VISA降解。另外,PKA活性抑制剂H89能够显著增加小鼠血清中EMCV感染诱导的IFN-β,IFN-α4,IL-6等细胞因子的表达水平,同时能够减缓EMCV感染引起的小鼠死亡。我们检测到病毒感染晚期细胞中的环化腺苷酸cAMP的含量明显上升,蛋白激酶PKA的活性也显著增强;外源添加的cAMP可以显著抑制细胞中病毒诱导的I型干扰素及下游抗病毒基因的表达,这与蛋白激酶PKA负向调节细胞抗病毒免疫反应这一功能相一致。这些结果共同表明,cAMP依赖的蛋白激酶PKA通过催化VISA第54位苏氨酸发生磷酸化修饰负向调控RNA病毒诱导的I型干扰素及下游抗病毒基因的表达,防止信号通路的持续激活和过度免疫反应的发生。此项研究发现将有助于为自身免疫性疾病的治疗和相关药物的研发提供更完备的理论依据和新的分子靶标。