研究背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种有鞭毛的螺旋状的革兰染色阴性微需氧弯曲细菌。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall首次从慢性活动性胃炎患者的胃窦黏膜活检组织中分离出H. pylori。近二十年以来,H. pylori作为人类感染率最高的致病性细菌之一,引起学术界极大的关注。近年Krajden和Ferguson分别从牙菌斑和唾液中分离和培养出H. pylori,口腔H. pylori成为一大热点。其研究内容包括：其一,使用PCR,分离培养法或尿素酶试验法等多种方法从口腔牙菌斑、唾液、黏膜组织、呕吐物中检测到H. pylori。其二,研究显示口腔H. pylori与多种口腔疾病的发生有关,包括复发性口腔溃疡、口臭、牙周炎、龋病等。其三,患者口腔H. pylori与胃内H. pylori一致,两者有互相传播的可能。如Ferguson等通过可溶性蛋白电泳,DNA的限制性内切酶分析证实口腔H. pylori与胃内H. pylori同源。其四,部分胃H. pylori再感染者与前次感染同源,其可能是胃内H. pylori根除后复发原因之一。如有国外学者研究发现1年后复发的患者经过随机引物PCR证实与前次感染同源。其五,口腔健康状态差或口腔中检测到H. pylori的患者三联疗法H. pylori根除率低。其六,还有研究证实目前的三联疗法能够清除胃内H. pylori,但不能清除口腔H. pylori。其可能与口腔牙菌斑特殊的“生物膜”有关。人类是H. pylori的自然传染源,胃是H. pylori最主要的寄居地,为学术界所公认。口腔H. pylori的分离和培养提示,口腔是H. pylori的另一聚集地。第一,H. pylori作为口腔众多微生物中的一种,影响整个或局部口腔微生态,可促进某些口腔疾病的发生和发展。第二,口腔H. pylori可能是胃内H. pylori感染和复发的重要因素,因而,抑制口腔H. pylori可使口腔和胃都有获益。鉴于H.pylori对抗生素耐药性的增加,以及口服抗生素对口腔H. pylori清除效果不理想,使之清除口腔H. pylori不同于传统的胃H. pylori根除的三联疗法。我国具有丰富的中医药资源,是人们生活医疗保健必不可少的一部分,中药具有取材容易、价格便宜、毒副作用小、不易产生耐药等优势,是新药开发的重要原料。因此,本文试图从多种以清热解毒为主的常用中药中筛选并组合成基础配方,它具有较强抗H. pylori活性,起到抑菌消炎和维护口腔微生态平衡的作用；同时在中医上具有止血、缓解疼痛等多种综合功效,可防治细菌引起的牙龈炎及由其发展的牙周疾病,为研制抑制口腔H. pylori的生长的口腔护理产品如牙膏、含片等提供理论基础。再者,口腔局部使用配合三联疗法根除H. pylori,完善目前的防治方法,从而降低胃H. pylori的感染率及复发率。本课题由三部分实验构成：第一部分,从在校大学生口腔分离培养H. pylori并分析其与牙龈炎的相关性,测试口腔H. pylori分离株对七种常用抗生素药物敏感性。第二部分,测试50种中药抗H. pylori标准株体外活性强度,并讨论几种具有强抗H. pylori活性中药的药性、归经、功效等。第三部分,筛选一组具有强抗H. pylori活性的中药组方,具有更强抗菌抗炎的作用,可局部用于口腔抑制H.pylori生长及口腔卫生保健。目的1.调查一般人群口腔H. pylori的感染率。2.分析口腔H. pylori与牙龈炎的相关性。3.测试口腔H. pylori分离株对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、庆大霉素和红霉素等7种常用抗生素的耐药性。方法1.研究人群：佛山科技学院的在校大学生,年龄18-25岁,均获得知情同意。(1)问卷检查排除以下：①吸烟；②系统性疾病,如糖尿病、出血性疾病、上呼吸道感染等；③近半年内接受过牙周治疗、服用过抗生素或非甾体类抗炎药；④明显的牙齿松动和严重的牙槽骨吸收、广泛的龋坏、牙齿错位。(2)一般口腔检查：经过有经验的临床牙科医生询问患者主诉、病史、自觉症状,依据患者牙周袋探诊深度(PD)、出血指数(SBI)和牙龈指数(GI)排除严重的牙周炎症疾病,牙周炎也被排除。并且将所有受试者分为牙龈炎组和无牙龈炎组。2.标本采集：用无菌刮勺刮取患者两侧切牙、尖牙、前磨牙、磨牙的龈上、龈下菌斑,并收集1ml的唾液,充分混合。3.细菌接种、分离、培养、传代、鉴定和保存：于微需氧环境下在选择性哥伦比亚固体培养基上培养。肉眼观察菌落,挑取可疑菌落传代培养,涂片,革兰染色,镜下观察菌体形态,尿素酶试验、触酶试验、氧化酶试验等生化试验鉴定。菌种保存于改良布氏肉汤甘油液体培养基。4.统计方法：应用分层分析卡方检验(SPSS13.0)分析牙龈炎与口腔H. pylori阳性率关系。5.抗生素敏感试验：运用K-B纸片法测试临床口腔H. pylori分离株对7种常用抗生素药物敏感性,用游标卡尺测量每种抗生素的抑菌环半径,参照中国药品生物制品鉴定所制订的药敏试验判定标准判断敏感、中度敏感和耐药。结果1.总计356名在校大学生接受了此项调查,其中男生152名,女生204名。诊断表明,总患牙龈炎率为30.9%(110/356)。2.从受试者多个牙位的牙菌斑口腔唾液共获取356份混合标本。分离培养、鉴定和保存了48(13.5%,48/356)株H. pylori菌株,患牙龈炎者H. pylori感染率为24.5%(27/110),未患牙龈炎者H. pylori感染率8.5%(21/246)。患牙龈炎者H. pylori感染率显著高于未患牙龈炎者,χ2=16.7,P=0.000(P<0.05)。3.男生组中,患牙龈炎者H. pylori感染率为20.8%(11/53),未患牙龈炎者H. pylori感染率为7.1%(7/99),患牙龈炎者H. pylori感染率显著高于未患牙龈炎者,χ2=6.192,P=0.013(P<0.05)。4.女生组中,患牙龈炎者H. pylori感染率为28.1%(16/57),未患牙龈炎者H. pylori感染率为9.5%(14/147),患牙龈炎者H. pylori感染率显著高于未患牙龈炎者,χ2=11.263,P=0.001(P<0.05)。5.甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、庆大霉素和红霉素的耐药率分别是83.3%(40/48),33.3%(16/48),14.6%(7/48),6.3%(3/48),29.2%(14/48),52.1%(25/48),27.1%(13/48)。结论1.口腔是H. pylori的储存地,在特定的情况下,牙龈炎可能为H. pylori定植于口腔提供了更为适合的微环境,或者口腔H. pylori的定植可能为牙龈炎发生的促进因素之一。而两者关系及作用机制尚需进一步研究。2.口腔H. pylori对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、庆大霉素和红霉素都有较高的耐药性。第二部分中药体外抗幽门螺杆菌活性筛选测试目的：评估50种常用中草药体外抗H. pylori活性,筛选出较强活性药物,为进一步临床应用抑杀H. pylori提供初步的理论依据。方法：用布氏肉汤倍比稀释法,测试50种中药水煎液物体外抗H. pylori悉尼标准株活性,用最小抑菌浓度(MIC)评估活性大小。结果：多种中药水煎液具有较强的体外抗H. pylori活性,其中黄连、黄芩、板蓝根三种水煎液抗H. pylori活性最强,最小抑菌浓度均为7.8mg/ml。结论：黄连、黄芩、板蓝根三种中药价格便宜,毒性低,副作用小,不易产生耐药性,有可能为新药的合成提供潜在原材料。第三部分筛选抑制口腔幽门螺杆菌生长的中药组方目的：拟研制一种抗口腔H. pylori的中药基础方,可长期局部用于口腔,抑制口腔H. pylori生长和繁殖,维持口腔微生态环境平衡,保持口腔健康。方法：以中药抗H. pylori最小抑菌浓度为基础,选三种具有强抗H. pylori活性的中药,并检测此三种中药对口腔分离株的MIC50、MIC75和MIC90,以三种药物作为三个因素,药物不同浓度为三个水平,采用正交设计法,进行9轮试验测定三种药物混合液的对口腔分离株抑菌率。结果：黄芩、金银花、蒲公英三种中药具有强体外抗H. pylori活性,中医学上药性、功效具有配伍加强效应,西医学上三者联合后抗H. pylori活性加强。结论：黄芩、金银花、蒲公英三种中药组成的配方抗菌抗炎作用加强,具有多种功效,标本兼顾,为下一步应用于临床提供理论基础和现实依据。