论文部分内容阅读
继生物光学显微镜、普适性生物荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜之后,双光子荧光显微镜已经成为新一代的细胞和组织的微观成像工具。与传统的单光子荧光共聚焦显微镜相比,双光子荧光显微镜在成像细胞和组织方面显示出了许多显著的优势：红外激发、生物样品穿透深度大、自发荧光低、生物样品的光损伤小、明显延长活细胞和组织的观测时间等。特别地,双光子荧光显微镜在对活性生物样品的观测上体现出了独特的优势,这使得生物科学家们得以在活的细胞和组织中观察和研究生命过程。荧光显微探测技术与荧光探针是相互依存互相促进的,新的荧光技术需要新的探针,新的探针将使探测技术更加完善。双光子荧光探针的研究是随着双光子荧光显微镜的出现而逐渐发展起来的,但其研究工作的相对滞后则限制了它们在双光子荧光显微镜上的广泛应用。因此,发展具有大活性吸收截面的、高荧光量子产率的双光子荧光探针具有非常重要的科学价值和研究意义。目前已有很多种特定用途的双光子荧光探针报道。这些探针主要有双光子核酸探针、双光子离子探针、双光子pH探针、双光子脂质筏探针以及双光子半胱氨酸/高半胱氨酸探针等。半胱氨酸(Cysteine, Cys)和高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)在细胞抗氧化系统中发挥着关键的作用。Cys和Hcy同时表达在真核细胞内,其分子结构上只有一个亚甲基的差别,但功能重要却完全不同：Cys是构成蛋白质和谷胱甘肽的氨基酸；Hcy与人类的心血管疾病、进行性老年痴呆症有直接关联。针对目前高选择性识别并成像细胞内Cys及Hcy的荧光探针尚不成熟、识别并成像细胞内Hcy的荧光探针尚无报道、高选择性识别并利用双光子荧光显微镜成像细胞内Cys的双光子荧光探针刚刚起步的状态,开展具有活细胞通透性的高选择性识别Cys或Hcy的双光子荧光探针的研究是非常重要的。本文成功设计并合成了能够高选择性识别Cys的双光子荧光探针并利用双光子荧光显微镜实现了其在活细胞中的荧光成像。本文利用Vilsmeier反应和Heck反应等有机化学反应,以三苯胺和咔唑为母体,我们成功地制备了一系列能够选择性识别Cys的双光子生物荧光探针,并通过核磁共振谱,元素分析,红外及质谱等手段对目标探针分子进行了结构表征。这类探针分子的合成路线简单,易于操作。这些探针分子分别用AM1、CA1、CA2、 CA3、ZA1和ZA2来表示。其中,CA2和CA3与CA1表现出了相似的性质,本论文着重讨论AM1、CA1、ZA1和ZA2的合成和性质。在大量实验研究中发现：AM1与CA1是对检测Cys具有高选择性的双光子荧光探针,分别发射红光与绿光,并且它们能够在活细胞中对Cys进行双光子荧光显微成像。AM1与CA1本身不具有双光子荧光性能,与Cys结合后,AM1+Cys在920nm激发下的双光子吸收截面则高达1700GM(1GM=10-50cm4s photon-1),而CA1+Cys在810nm激发下的双光子吸收截面为90GM,其作用环境分别是乙腈-Tris/HCl(v/v,4:1, tris:10mM, KCl:100mM, pH=7.27)混合溶液和甲醇-Tris/HCl(v/v,4:1, Tris:10mM, KCl:100mM, pH=7.00)混合溶液。特别地,在双光子800nm激发下,AM1+Cys的双光子荧光强度分别是AM1+NAC(N-乙酰基半胱氨酸),AM1+Hcy和AM1的11倍、67倍和60倍,而CA1+Cys的双光子荧光强度分别是CA1+NAC, CA1+Hcy和CA1的2.64倍、77倍和59倍。为了进一步考察AM1和CA1与Cys之间的相互作用,我们对AM1和CA1与Cys进行了紫外吸收、单光子荧光、双光子荧光光谱滴定实验。其结果表明,当Cys与AM1或CA1之间的摩尔比小于30时,探针的光物理性质没有明显的改变,当摩尔比在30-60之间时,吸光度,单、双光子荧光强度迅速增强,当摩尔比大于60时,这些光物理性质均保持稳定；AM1和CA1对Cys的检测极限大约在293-408μM。同时关于探针AM1和CA1的选择性我们还做了详细的实验分析,发现只有在加入Cys的情况下,探针的吸光度与单、双光子荧光强度发生显著的变化,并伴随明显的溶液颜色变化。因此,AM1和CA1既是对Cys具有高选择性识别性能的光开关型((turn-on)双光子荧光探针,又可以作为检测Cys的裸眼探针。我们还研究了生理范围内pH值的变化对AM1和CA1荧光强度的影响：在pH=4-7.5范围内,pH值的变化对AM1和CA1荧光性能的影响很小且可以忽略,进而认为它们在生物细胞中的应用不会受到生理环境中pH变化的影响。另外,我们还对AM1和CA1与Cys作用的机理进行了详细的探讨。与AM1和CA1相比,ZAl和ZA2是能够专一识别Cys的单光子荧光探针。ZA1和ZA2本身没有荧光,当它们与Cys结合后发射较强的蓝色荧光,其荧光强度分别增强105倍和200倍,而当加入其它生物分析物后,探针的紫外吸收光谱和荧光光谱并没有明显改变。另外,我们还实现了ZA1和ZA2在活细胞中对Cys的宽场成像。综上,本文成功地设计并合成了一系列具有高选择性的Cys荧光探针,并且发射了红、绿、蓝三种颜色的荧光。特别地,AM1和CA1是具有高选择性的双光子Cys荧光探针。而且,本文对AM1和CA1与Cys的作用机理以及它们在活细胞中对Cys的双光子荧光成像进行了详细的研究。本文为得到商品化的Cys荧光探针奠定了基础。