【背景】黏液表皮样癌(Mucoepidermoid carcinoma, MEC)是人涎腺恶性肿瘤中最常见的恶性肿瘤，据文献报道约占涎腺恶性肿瘤的30%，占所有涎腺肿瘤的5%到10%。根据临床表现和病理学分级，MEC可以分为高分化型、中分化型及低分化型三种。高中分化型患者常规手术治疗后预后很好，但是低分化患者易出现早期转移，术后临床预后很差，转移癌患者一般仅存活两至三年。目前化疗仍是治疗转移癌的主要方案，但对低分化MEC患者而言，收效甚微。其主要原因在于其低分化表型及多药耐药特性，导致化疗药物的不敏感性。因此，探讨黏液表皮样癌耐药机制、筛选开发对黏液表皮样癌具有选择性抑瘤作用的药物对于低分化MEC患者具有重要意义。【目的】（1）利用我科前期建立的高转移人涎腺粘液表皮样癌MC3细胞系，建立稳定的耐药细胞系MEC/5-FU，并探索其可能的耐药机制。（2）利用MC3细胞和MEC/5-FU细胞建立裸鼠移植瘤模型，探索移植瘤生物学特性并确定动物模型的耐药特性，为探索黏液表皮样癌耐药机制及筛选敏感药物建立动物模型。（3）研究中药单一成分黄芩苷对MC3细胞及其移植瘤的抑瘤作用。检测黄芩苷对MC3细胞增殖、凋亡的影响，初步探索可能的抑瘤机制。（4）研究黄芩苷对多药耐药MEC/5-FU细胞株及其裸鼠移植瘤的抑瘤作用。检测黄芩苷对MEC/5-FU细胞增殖、凋亡的影响，以及对耐药相关基因和相关蛋白表达的影响，探索黄芩苷对黏液表皮样癌耐药细胞是否具有逆转耐药的作用及可能机制。【方法】（1）采用大剂量冲击联合递增维持浓度的方法，利用5-FU诱导高转移人涎腺粘液表皮样癌MC3细胞，建立稳定的人涎腺黏液表皮样癌细胞系耐药细胞株(MEC/5-FU)。采用MTT法分别检测5-氟尿嘧啶、阿霉素、表阿霉素、平阳霉素、博莱霉素、阿糖胞苷、顺铂、丝裂霉素、柔红霉素、紫杉醇等对对MC3细胞和MEC/5-FU细胞增殖的抑制效应，计算耐药指数。（2）将人涎腺黏液表皮样癌多药耐药MEC/5-FU细胞接种于裸鼠表皮下，待肿瘤成瘤后，按15mg/kg剂量腹腔注射5-FU进行体内诱导2周，建立稳定的黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型。取移植瘤原代培养细胞进行耐药性检测。（3）采用MTT法检测黄芩苷对MC3细胞和MEC/5-FU细胞的抗增殖作用，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜观察细胞的形态学及超微结构的改变；应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡率；用RT-PCR及免疫荧光染色技术检测相关基因mRNA及蛋白表达水平情况；初步探讨黄芩苷对MC3细胞和MEC/5-FU细胞的抑瘤机制。（4）构建高转移MC3细胞和多药耐药MEC/5-FU细胞的裸鼠移植瘤模型。肿瘤细胞接种后采用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积，待肿瘤生长至约300mm3后，对荷瘤裸鼠进行随机分组，采用不同浓度的黄芩苷模拟临床用药，观察裸鼠生长情况，计算各组用药抑瘤率。通过病理组织学及电镜扫描观察瘤组织超微结构。（5）采用Agilent人类全基因4*44K芯片检测比对MC3细胞和MEC/5-FU细胞基因表达差异情况，结果选用National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID), NIH提供的DAVID Bioinformatics Resources软件进行分析，对丰度计分（Enrichment Score ES）大于1的进行差异表达基因功能分类。RT-PRC验证耐药相关基因表达情况，罗丹明123蓄积试验检测耐药细胞株ABC转运蛋白超家族（ATP-binding cassette,ABC）药泵作用。（6） MiRNAs芯片检测比较MC3细胞与MEC/5-FU细胞间miRNAs表达差异情况，以及黄芩苷作用前后MEC/5-FU细胞中miRNAs表达改变情况。筛选分析与细胞周期、细胞凋亡和多药耐药性相关的miRNAs差异表达并采用Realtime-PCR进行验证，初步探索miRNAs分子在黏液表皮样癌耐药分子事件中的作用。【结果】（1）经过14次的大剂量冲击及逐渐提高维持剂量，成功建立稳定的耐药细胞系MEC/5-FU。该细胞能在含有1μg/ml5-FU的血清培养液中稳定生长和传代，对5-FU的耐药倍数达到36.11，并且对其它多种抑瘤机制不一样的化疗药物表现不同程度的交叉耐药性。多次冻融复苏后耐药性能稳定，该细胞在形态学和生长特性方面与亲本细胞MEC细胞系比较未见明显改变。（2） MEC/5-FU细胞接种于裸鼠皮下约14天后，肿瘤体积长到约300mm3,继续腹腔注射15mg/kg的5-FU进行体内诱导，连续注射两周后取移植瘤进行原代培养获得移植瘤MEC/5-FU/NU原代细胞，MTT检测原代MEC/5-FU/NU细胞的耐药性，明确建立稳定的黏液表皮样癌耐药动物模型。HE结果表明原代培养的MEC/5-FU/NU细胞与体外培养细胞组织学结构类似，对5-FU的耐药指数为27.82。RT-PCR显示耐药相关基因ABCB1、ABCB11、GSTA1耐药相关基因在MEC/5-FU/NU细胞中明显高表达。免疫荧光显示多药耐药蛋白MDR-1在MEC/5-FU/NU细胞中高表达。（3） MTT药敏实验结果显示黄芩苷能显著抑制MC3细胞增殖，72小时半数抑制浓度(IC50)约为40μg/ml。100μg/mL和320μg/mL的作用72h后的MC3细胞抑制率分别为75.42±4.36%和91.58±2.14%。细胞周期分析显示，与对照组比较，40μg/ml黄芩苷作用72h后细胞被阻滞于G0/G1期，比率由57.28%上升到68.94%，而S期细胞比率由40.54%降低到24.10%，P=0.0023。AnnexinV FITC/PI法检测到凋亡细胞，且细胞凋亡率呈浓度依赖性，40μg/ml作用72h后MC3细胞的凋亡率由2.80%升高到14.47%，P=0.0004。Hoechst33342染色显示黄芩苷作用组细胞出现细胞核浓缩、DNA碎片等典型凋亡特征。（4）黄芩苷可抑制裸鼠MC3细胞皮下移植瘤的生长，呈剂量依赖性。200mg/kg黄芩苷组用药两周后肿瘤平均体积为1233.02mm3，阴性对照组平均体积为2682.67mm3，抑瘤率为54.04%。瘤组织病理组织学和透射电镜检查结果显示：黄芩苷用药组肿瘤坏死和细胞凋亡现象较阴性对照组多见。（5）黄芩苷对MEC/5-FU细胞及其裸鼠移植瘤均具有显著的抑制作用。黄芩苷对耐药细胞的72h半数抑制浓度(IC50)约为68.75μg/ml。200mg/kg黄芩苷组用药两周后肿瘤平均体积为1682.0mm3，阴性对照组肿瘤平均体积为3259.0mm3，抑瘤率为44.66%。RT-PCR结果显示黄芩苷作用MEC/5-FU细胞后，ABCB1、和ABCC1基因的mRNA表达水平未见降低，MEC/5-FU细胞对荧光染料罗丹明123的泵出率也未见显著下降。（6）基因芯片结果显示，与亲本细胞MC3细胞比较，耐药细胞MEC/5-FU有7516个基因表达出现上调（比率大于2.0），7275个基因表达出现下调（比率小于0.5）。上调基因多属于生长因子类、细胞外基质等基因，下调基因多属于细胞周期蛋白类、DNA合成和修复、细胞凋亡相关及细胞受体相关基因。挑选出ABCA2、ABCB1、ABCB11、 ABCC1、 ABCC4(MRP4)、 GST T1、GSTA1、TOP2A、TOP2B、CASP3等10个与耐药相关的差异表达基因进行RT-PCR验证。与其亲本细胞MC3相比，MEC/5-FU细胞中ABCB1、ABCB11、ABCC4和GSTA1等耐药相关基因的mRNAs表达上调表达显著上调，而ABCA2、ABCC1、CASP3、GSTT1、TOP2A、TOP2B、等耐药相关基因mRNAs表达未见显著差异。罗丹明123蓄积实验显示MEC/5-FU细胞内荧光信号强度显著降低，表明耐药细胞胞浆内罗丹明123蓄积量显著下降。（7）基因芯片结果和RT-PCR结果显示ABCC1(MRP1)在两种细胞中表达量恒定，但是免疫细胞化学结果显示在MEC/5-FU细胞中出现特异性和定位。采用RNAi技术降低MRP1表达后细胞耐药性显著下降，且RNAi技术主要降低MEC/5-FU细胞核内的MRP1的表达。（8） MicroRNA芯片结果显示与亲本MC3细胞比较，共有19个miRNAs表达出现上调，11个miRNAs出现表达下调。对于MEC/5-FU细胞，黄芩苷处理组与未处理组比较共有162个miRNAs表达出现上调，13个miRNAs出现表达下调。我们选取与miR-34、miR-107、miR-125a和miR-202进行Realtime-PCR验证，却未检出显著差异表达。【结论】（1）经过反复冲击并缓慢提高维持浓度，以及反复冻融复苏，最终成功建立了稳定的黏液表皮样癌多药耐药细胞系MEC/5-FU，该细胞能在1μg/ml的5-FU培养液中稳定生长和传代，对5-FU的耐药倍数达到36.11，对多种抑瘤机制不同的化疗药物表现不同程度的交叉耐药性。并利用该耐药细胞模型成功建立多药耐药的裸鼠移植瘤模型。（2）黄芩苷可通过将细胞阻滞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡来抑制高转移人涎腺粘液表皮样癌MC3细胞增殖。动物实验结果表明并能显著抑制裸鼠移植瘤的生长，诱导瘤组织中MC3细胞的凋亡。（3）黄芩苷能显著诱导MEC/5-FU细胞凋亡，并对其裸鼠移植瘤均具有显著的抑制作用。黄芩苷与5-FU联用具有协同抑制MEC/5-FU细胞裸鼠异种移植瘤生长的作用。（4） ABC转运蛋白超家族中的ABCB1（MDR1）在MEC/5-FU耐药细胞中显著高表达，并能将罗丹明荧光染料主动运输出胞外，在MEC/5-FU细胞耐药机制中起主要作用。（5）黄芩苷作用对MEC/5-FU细胞中ABCB1、ABCC1等耐药相关基因的表达无影响。药物蓄积实验结果表明黄芩苷作用前后MEC/5-FU细胞对罗丹明123染料的蓄积量无显著差异，提示黄芩苷对耐药细胞中ABC转运蛋白超家族药泵作用无影响。（6）首次发现MRP1在MEC/5-FU细胞中整体表达量不变的情况下出现了细胞核转移现象。RNAi技术可以显著降低MEC/5-FU细胞核中高表达的MRP1，降低耐药细胞对5-FU的耐药性。据此我们推测MRP1可能在细胞核内以调控分子的形式参与了黏液表皮样癌的耐药。具体调控通路有待进一步研究。（7） MicroRNAs芯片结果提示与亲本亲本细胞MC3细胞相比，MEC/5-FU耐药细胞系中多种miRNAs出现表达异常。提示miRNAs异常表达可能参与了黏液表皮样癌的耐药调控。选择表达差异显著的miR-202*（差异倍数3.179）、miR-125a（差异倍数0.0013）进行Realtime PCR验证，结果表明二者在两组细胞间的表达无明显改变。它们在黏液表皮样癌耐药细胞中是否存在差异表达及是否参与调控耐药还有待进一步研究。（8） MicroRNAs芯片结果提示黄芩苷处理前后， MEC/5-FU细胞系中多种miRNAs出现表达异常。其中miR-34a*和miR-107差异表达明显，其ratio值分别为3.8891048和0.0009556。但是Realtime-PCR验证结果表明二者在两组细胞间的表达无明显改变。它们在黄芩苷抑制MEC/5-FU细胞增殖的过程中是否发挥作用还有待进一步研究。