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一富硒细菌抗氧胁迫及高硒细菌的驯育深刻理解抗生素引起的细菌细胞生理反应对开发新型抗菌药物至关重要。最新研究表明杀菌性抗生素引起的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）参与了细菌氧化应激反应,大分子损伤乃至细胞死亡的全过程,ROS过量同样对动植物细胞也会造成巨大损伤。因此,如何有效防范或降低细胞内ROS剧烈波动是目前研究的一个热点和难题。研究发现硒蛋白在维持细胞内氧化还原平衡,防止ROS引起的氧化性损伤中发挥着重要作用。许多硒化物具有抗氧化的生化特性,特别是硒酶在细胞（动植物细胞）内有阻断或抵御细胞ROS激增潜在可能性。基于此本文以模式生物大肠杆菌为对象系统研究了无机硒在微生物胞内代谢情况,高硒培养对细菌生长的影响,富硒菌体细胞内氧化还原关键酶（SOD和catalase）活性以及富硒菌体总抗氧化能力变化,富硒细菌对抗生素引起的氧化胁迫的反应,富硒细菌对抗生素耐受性的变化等科学问题。此方面主要研究内容和结果具体如下:⑴富硒细菌对抗生素引起的氧化胁迫应激响应分析。研究表明富硒细菌在接触高致死剂量的杀菌性抗生素时细菌的敏感性显著变化,富硒菌体对抗生素的耐受力明显提高;同时富硒细菌与无硒菌体相比菌体细胞的总抗氧化能力明显提高,并且菌体细胞的总抗氧化水平与细胞内总硒含量成正相关关系。经过实时测定显示富硒细菌在ROS诱导剂Rosup或高剂量抗生素作用时,胞内ROS水平总体保持稳定,没有瞬时激增的现象。而未经硒培养的细菌经ROS诱导剂或高剂量抗生素作用胞内ROS显著提升。结合富硒细菌对抗生素的耐受性实验结果可以推测富硒细菌抗生素耐受性的提高与富硒细菌抗氧化胁迫能力的增强有密切关系。⑵富硒培养对菌体SOD酶和过氧化氢酶活力的影响。研究发现经过硒处理的细菌其菌体总SOD活性水平要高于未经硒培养的野生型菌体。并且细菌在不同的培养时段其不同SOD酶活表达有一定差异。整体上富硒菌体的过氧化氢酶活力要高于无硒菌体。采用相应酶抑制剂（二乙基二硫氨基甲酸钠DDC抑制SOD酶活性,氨基三唑CAT抑制catalase）孵育菌体后,富硒菌体相比无硒培养的菌体对环丙沙星的耐受性显著提高。⑶富硒培养对大肠杆菌生长的影响及耐高硒菌株的选育。本研究筛选获得了富硒优势菌株E.coli C5。该菌株能在高硒痕硫环境下连续传代培养且相比其它野生型菌株（E.coli ATCC25922,E.coli 23）在同样高硒痕硫环境下有生长优势。利用ICP-MS法测定了在高硒痕硫（M9+2 mM H2SeO3-S）环境下获得的E.coli C5菌体中硫硒含量,结果显示菌体湿重条件下硫/硒比为0.059/1,而高硫环境下培养的菌体中硫/硒比高达105/1。结果揭示细菌在高硒环境下培养后即使高浓度无机硒对细胞毒害较大但仍有部分菌体细胞经适应性驯化后逐渐适应高硒环境并维持自身生长。对富硒细菌的超微结构观测发现:富硒细菌依然保持细胞完整性,但细胞壁比较松散,细胞内部有明显颗粒聚集。结果同样揭示细菌高硒培养虽然对菌体生长有一定抑制作用,但经适应性驯化后的细菌在高硒环境下依然能保持细胞完整性和一定的繁殖力。二新型增效剂SIPI-8294诱导氧胁迫抗MRSA的研究近年来基于蛋白组学技术的抗菌机制及细菌耐药机制研究,打开了一扇能够看到细菌接触抗生素后引起内部蛋白网络变化的缤纷世界。而如何从“海量”的组学数据中发现、并用分子生物学等方法验证网络中造成细菌耐药性的“关键推手”,成为了目前的研究热点。本文首先对本实验室发现的新型组合药物（SIPI-8294联合β-内酰胺类抗生素）抗MRSA体外初步药效进行了研究。同时针对前期组合药物协同抗MRSA蛋白组学数据结合抗生素引起的ROS杀菌理论,本文深入分析了组合药物引起的MRSA胞内与氧化胁迫相关的代谢通路和基因。此方面的研究结论具体如下:⑴新型红霉素类衍生物具有显著降低苯唑西林对MRSA ATCC43300的MIC,其中代表化合物SIPI-8294能够不同程度地降低各种β-内酰胺抗生素对MRSA ATCC43300的MIC,以及降低苯唑西林对临床分离MRSA株的MIC。在联合用药实验中,8mg/L的SIPI-8294最高的能够降低细菌对抗生素的MIC达到128倍,而最低的只能降低1倍。构效关系优化后合成了大量SIPI-8294结构类似物,体外药效评价显示:部分化合物相比SIPI-8294,它们与苯唑西林联合抗MRSA时有更好的增效作用,尤其L169,L170两个化合物即使联合时使用剂量为2μg/ml时,也能显著降低Oxacillin的用量（≤8μg/ml）。⑵研究发现虽然新型红霉素类衍生物母体结构与目前临床应用的第二代和第三代红霉素衍生物相似,但它们与β-内酰胺抗生素联合抗MRSA ATCC43300时体外药效却明显不同。同样SIPI-8294与β-内酰胺酶抑制剂分别与苯唑西林联合抗MRSA ATCC43300时体外药效也明显不同。研究结果表明SIPI-8294及其结构类似物在联合β-内酰胺抗生素抗MRSA过程中有潜在未知的抗菌机制需要深入探索。⑶对MRSA ATCC43300在组合药物作用下的蛋白组进行KEGG代谢通路分析,蛋白同源聚类（COGs）功能分析发现:组合药物引起的蛋白组变化中可能与氧化胁迫有关的通路有“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”,“嘧啶代谢”,“嘌呤代谢”,“三羧酸循环”等代谢通路。对代谢通路中显著变化的蛋白进行分析发现:单独用SIPI-8294处理MRSA菌体延胡索酸酶（fumC）上调1.743倍和丙酮酸羧化酶（pycA）上调12.5倍。而在组合药物作用下,TCA循环中延胡索酸酶（fumC）同样上调2.057倍,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pckA）上调5.346倍,柠檬酸合成酶上调2.9倍。这些TCA循环中关键酶的变化会对TCA正调控,进而加速电子传递、能量转运和物质转化,进而可能诱发ROS激增。