动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）疾病是多因素引起的慢性炎性反应。现已确认血脂异常是其重要危险因素。流行病学研究表明,高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）胆固醇（HDL cholesterol,HDL-C）水平与动脉粥样硬化性心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）的风险呈负相关。HDL的动脉粥样硬化保护作用与它们在反向胆固醇转运（reverse cholesterol transport,RCT）中发挥关键作用有关。目前开发了一些旨在提高HDL-C水平的药物,比如增加载脂蛋白A-I（apoprotein AI,apoAI）水平的药物,已经在临床前研究或冠心病患者中发挥出一些的疗效。然而,增加HDL-C水平对心血管疾病有益的推断越来越受到质疑,因为在大多数临床试验中,单纯地升高HDL-C水平并未导致心血管疾病预后改善。因此,旨在恢复HDL功能可能比迄今为止用于升高HDL-C水平的药物更能发挥治疗As的作用。清道夫B类1型受体（scavenger receptor class B type I,SR-BⅠ）是一种多配体生理性HDL膜受体蛋白,主要功能是通过选择性摄取的非内吞机制促进胆固醇酯从高密度脂蛋白转运到细胞。除了促进选择性胆固醇流入细胞外,SR-BⅠ还促进了游离的胆固醇从外周组织（包括巨噬细胞）向HDL流出。SR-BⅠ在多种组织和细胞类型中表达,包括脂肪细胞,巨噬细胞,内皮细胞等。在啮齿动物中,SR-BⅠ在肝脏和肾上腺,巨噬细胞以及生成类固醇激素的细胞上广泛表达,其中,分布在肝细胞与巨噬细胞上的SR-BⅠ与AS密切相关。巨噬细胞SR-BⅠ介导胆固醇流动是双向的,胆固醇净移动取决于胞内脂质含量以及胆固醇梯度的方向。SR-BⅠ在促进荷脂细胞的胆固醇双向流动中发挥了重要作用。巨噬细胞SR-BⅠ的失活促进apoE缺陷小鼠(apoE^-/-)以及LDL受体缺陷小鼠(LDLR^-/-)AS的发展。然而,巨噬细胞SR-BⅠ可能对AS的形成具有双重作用,据报道SR-BⅠ促进AS早期病变,而抑制AS晚期病变。这些观察结果表明SR-BⅠ在调节巨噬细胞胆固醇体内平衡中起双重作用。肝细胞SR-BⅠ主要参与RCT的终末环节,介导选择性脂质摄取（selective lipid uptake,SLU）进入肝脏,促进血浆的HDL-C清除。有研究表明,血浆中HDL-C水平会由于肝脏SR-BⅠ过表达而降低,并且因肝脏SR-BⅠ基因缺失而增加。然而,即使血浆中HDL-C浓度低,SR-BⅠ的上调能缓解LDLR^-/-鼠的AS形成,SR-BⅠ基因敲除则加剧了动脉粥样硬化的形成。因此,SR-BⅠ选择性HDL-CE摄取途径现已被评价用于防治AS的可能性。MicroRNAs（miRNAs）是一类高度保守的单链非编码小RNA（长度约22个核苷酸）,通过碱基配对靶向mRNA 3’非编码区（3’untranslated regions,3’UTR）,促使靶mRNA的降解或抑制其转录来调节基因的表达。已有研究表明,miRNAs分子在HDL代谢,脂质稳态等方面起重要的调节作用,并且已经作为治疗包括AS在内的心血管疾病重要靶点。文献报道miR-96与胞内脂质稳态密切相关。高脂饮食可诱导C57BL/6N小鼠体内miR-96表达上调,另外,miR-96影响固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs）的表达。生物信息学提示,在多种生物物种中SR-BⅠ的3’UTR和miR-96存在保守性结合位点,那么miR-96是否能通过靶向作用SR-BⅠ的表达,抑制胞内胆固醇摄取,流出和RCT,引起细胞内脂质积聚与血管壁脂质沉积,最终导致AS的形成。环状RNA（circular RNA,circRNA）是近年来报道的一类非编RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）,能够和miRNA竞争结合mRNA 3’UTR的miRNA反应元件（microRNA response elements,MRE）,发挥竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）的功能,剔除miRNA对靶mRNA的抑制作用,从而在转录后水平增加microRNA靶基因的表达。现已证实,在多种疾病的发展过程中circRNA调控网络存在异常。前期应用生物信息学成功预测了环状RNA circ₀029343能与miR-96靶向结合,并且发现其在AS斑块中能够表达,那么circ₀029343是如何调控miR-96,能否通过结合miR-96来调控miR-96靶基因的表达,从而影响AS的进程。然而,目前未见相关文献报道。为了研究circ₀029343对AS过程中生物学行为的影响,我们通过THP-1巨噬细胞,HepG2肝癌细胞以及apoE^-/--鼠进行验证,以circRNA可能发挥竞争性内源RNA作用为切入点,阐明circ₀029343在apoE^-/-鼠AS过程中的作用机制。第一章miR-96靶基因的预测及其与SR-BⅠ 3’UTR的靶向作用目的:预测SR-BⅠ 3’UTR存在与miR-96靶向结合位点,并在人THP-1单核细胞及HepG2肝癌细胞验证靶向结合的可能性。方法:1.miR-96成熟序列通过查询miRBase数据库获得,SR-BⅠ 3’UTR序列通过访问GeneBank网站获得,SR-BⅠ 3’UTR与miR-96结合情况通过访问TargetScan与miRanda网站进行分析,SR-BⅠ 3’UTR与miR-96结合的自由能在查询miRanda网站获取。2.基于上述预测分析结果,分别构建野生型psiCHECK-2-SR-BⅠ-UTR-W与突变型psiCHECK-2-SR-BⅠ-UTR-Mut重组质粒,并与腺病毒质粒pMIR96（miR-96）、miR-96抑制剂（anti-miR-96）瞬时共转染至HEK293T细胞以测定荧光素酶报告基因活性。3.将miR-96/anti-miR-96和各自相应的对照转染到THP-1单核细胞和HepG2肝癌细胞,通过RT-PCR以及Western blot方法测定SR-BⅠ的mRNA与蛋白水平。结果:1.生物信息学预测分析表明miR-96能够与人/鼠SR-BⅠ 3’UTR结合,并且两者之间结合的自由能低。2.将miR-96与野生型psiCHECK-2-SR-BⅠ-WT 3’UTR共转染后荧光素酶相对活性明显受到抑制,与anti-miR-96转染后其活性增加。而与突变型共转染后,荧光素酶相对活性则无变化。3.miR-96转染后能抑制人THP-1单核细胞和HepG2肝癌细胞中SR-BⅠ mRNA与蛋白表达,而anti-miR-96转染则出现相反的结果。结论:miR-96能够靶向作用SR-BⅠ 3’UTR,抑制人THP-1单核细胞和HepG2肝癌细胞中SR-BⅠ的表达。第二章miR-96对巨噬细胞及肝细胞选择性HDL-CE摄取的影响目的:观察miR-96是否通过抑制SR-BⅠ基因的表达来调控THP-1及HepG2细胞Dil-HDL与HDL-CE的摄取,改变胞内脂质含量。方法:1.培养人THP-1及HepG2细胞,用腺病毒pMIR96、anti-miR-96转染细胞,流式细胞术观察THP-1及HepG2细胞Dil-HDL的摄取情况,同位素¹²⁵I-TC与[³H]CEt双标HDL观察THP-1及HepG2细胞选择性HDL-CE摄取情况。2.TC检测试剂盒评估胞内TC的水平,HPLC法测定THP-1细胞内TC,FC以及CE的含量,液体闪烁计数仪检测THP-1细胞内胆固醇流出,RT-PCR分别测定胰岛素诱导基因-1（insulin induced gene-1,Insig-1）、三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ATP binding cassette transporter G1,ABCG1）及固醇调节元件结合蛋白-1c/2 mRNA水平。结果:1.相较于control组,转染腺病毒pMIR96的THP-1及HepG2细胞,Dil-HDL摄取及选择性HDL-CE摄取均明显减少。2.HepG2细胞内TC水平减少,而THP-1细胞内脂质含量增加。anti-miR-96转染后,上述结果则出现相反的变化。此外,腺病毒pMIR96转染后,THP-1细胞内Insig-1表达下调,SREBP-lc/2表达上调。结论:1.miR-96通过抑制SR-BⅠ基因的表达减少THP-1及HepG2细胞脂质摄取。2.miR-96增加THP-1细胞内脂质含量可能源于对胆固醇流出的抑制及对胆固醇合成基因表达的增加。第三章circ₀029343通过靶向捕获miR-96对巨噬细胞及肝细胞选择性HDL-CE摄取的影响目的:预测hsa_circ₀029343存在与miR-96靶向结合序列,并通过靶向抑制miR-96增强SR-BⅠ的功能,最终影响THP-1及HepG2细胞内脂质含量。方法:1.通过查询CircNet数据库获取SCARB1/MIR/CIRC互作网络图,通过查询starbase数据库获取circRNA与miR-96-5p结合情况,在deepBase、CircBase及Gene Bank数据库查询SR-BⅠ编码的circRNA序列。基于上述预测结果,分别构建野生型质粒pCK-circ₀029343-WT与突变型pCK-circ₀029343-Mut重组质粒,测定荧光素酶报告基因活性;RNA FISH实验观察circ₀029343在胞内定位情况。2.构建过表达circ₀029343质粒,流式细胞术观察circ₀029343过表达对THP-1及HepG2细胞Dil-HDL摄取的影响,同位素¹²⁵I-TC与[³H]CEt双标HDL观察circ₀029343过表达对THP-1及HepG2细胞HDL-CE选择性摄取的影响,TC测量试剂盒评估胞内TC的水平,HPLC法测定THP-1细胞内TC,FC以及CE的含量;干扰circ₀029343表达后,再检测上述指标的变化。3.RNA pull-down及qRT-PCR检测circ₀029343与miR-96的结合情况,RNA FISH实验观察circ₀029343与miR-96在胞内定位情况;circ₀029343过表达质粒、腺病毒pMIR96及相应对照共转染后,Western blot检测circ₀029343靶向结合miR-96对THP-1与HepG2细胞SR-BⅠ表达的影响以及细胞脂质摄取及脂质含量的变化。结果:1.hsa_circ₀029343可以靶向结合miR-96-5p,并且位于THP-1细胞浆。2.circ₀029343过表达后THP-1及HepG2的Dil-HDL摄取及选择性HDL-CE摄取均明显增强,HepG2细胞内TC水平增加,而THP-1细胞内脂质含量减少;干扰circ₀029343表达后上述结果出现相反的变化。3.circ₀029343与miR-96共定位THP-1细胞浆中,circ₀029343通过靶向结合miR-96后,THP-1与HepG2细胞SR-BⅠ表达,Dil-HDL摄取及选择性HDL-CE摄取均明显增加。结论:1.circ₀029343通过靶向结合miR-96增加THP-1和HepG2细胞SR-BⅠ的表达。2.circ₀029343通过靶向miR-96增强SR-BⅠ的功能,THP-1及HepG2细胞脂质摄取增加,HepG2细胞内TC水平增加,而THP-1细胞内脂质含量减少。第四章circ₀029343通过调控miR-96影响apoE基因敲除鼠动脉粥样斑块形成目的:探讨circ₀029343靶向结合miR-96对apoE^-/--小鼠体内SR-BⅠ表达,RCT,血脂水平、肝脏与动脉壁脂质沉积及AS进程的影响。方法:1.高脂饮食饲养60只apoE^-/--小鼠,miR-96对小鼠功能实验中随机分为4组:腺病毒pMIR96 negative control（miR-NC）,腺病毒pMIR96组（miR-96）,miR-96 antagomir negative control（AN-NC）,miR-96 antagomir组（AN）。主动脉及肝脏组织SR-BⅠ的表达用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学检测,体内RCT效率用³H-胆固醇放射性来测定,血浆及肝脏组织脂质水平用试剂盒检测,主动脉窦及肝脏组织病变,脂质沉积及胶原纤维的水平分别用HE、油红O及Masson三色染色进行观察。2.circ₀029343对小鼠功能实验中分为4组:腺病毒pMIR96 negative control（miR-NC）,腺病毒pMIR96组（miR-96）,miR-NC与circ₀029343共转染组（miR-NC+circ₀029343）,miR-96与circ₀029343共转染组（miR-96+circ₀029343）,所有检测指标及方法同前。结果:1.相较于control组,miR-96组小鼠体内主动脉及肝组织SR-BⅠ表达下调,体内RCT受到损害,肝组织及血浆脂质水平升高,主动脉窦及肝脏组织病变及脂质沉积加重,而AN组小鼠上述指标则呈相反的趋势。2.circ₀029343拮抗miR-96在小鼠体内的功能,体内RCT得到改善,肝组织及血浆脂质水平下调,主动脉窦及肝脏组织病变及脂质沉积减轻。结论:1.miR-96降低apoE^-/--小鼠体内RCT效率,加重血管壁及肝脏组织的脂质沉积,加快AS进程。2.circ₀029343拮抗miR-96在小鼠体内的上述功能,circ₀029343拮抗miR-96在体内功能可能与增强SR-BⅠ功能有关。