研究背景：慢性阻塞性肺气肿(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种常见的、以气流受限不完全可逆并呈进行性发展的慢性炎症性疾病。终末期重度慢性阻塞性肺气肿因其发病率不断上升,致残率和死亡率高,其诊治使社会经济负担不断加重,因此,COPD的诊治已成为世界卫生的一个重要问题。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)的统计与分析,2020年,全球COPD将成为第三大致死病因。由于其患病人数多,死亡率高,社会经济负担重,对人类公共健康构成了非常严重的威胁,因此越来越受到医学界的关注。肺气肿作为COPD的主要病理改变之一,目前已成为COPD研究中的焦点。对于晚期重度肺气肿的病患者,外科肺减容手术(Lung volume reduction surgery, LVRS)是上世纪50年代由美国Brantigan医师提出的治疗终末期弥漫性肺气肿的手术方法,其核心概念是切除那些无功能的,过度膨胀的肺组织,纠正因肺过度膨胀造成的一些病理生理影响,从而改善呼吸功能。但因当时的手术死亡率高,医学界没有接受。上世纪90年代初,学者Cooper引入了内镜器械切割微创缝合技术,改进了手术方式,应用垫片加强切缘的闭合,使得手术风险有所改观。自1994年,我国外科肺减容手术引入以来,已成为终末期重度肺气肿的有效治疗方法,国内外大量文献表明LVRS能够显著改善肺功能,提高患者生活质量。研究结果认为,LVRS对于非均质性肺气肿能确切地改善肺功能。随着医学基础理论的发展,外科肺气肿的手术治疗有以下：肺大疱切除术,区域靶区肺组织切除术以及肺移植术,均取得了肯定的临床效果。目前认为外科手术肺减容术治疗肺气肿的主要机制为通过折叠或局部切除过度气肿的肺组织以解除受压迫的正常肺组织,恢复肺弹性,减少气道梗塞,改善膈肌和胸廓的运动功能,改善通气/血流比值和血流动力学,最终改善病人肺功能和缓解呼吸困难症状。胸腔镜肺大疱切除仅适用于少部分大泡性肺气肿病人；双肺移植术因为供体有限、手术难度大,要求高及费用昂贵而受到一定程度的限制。区域靶区肺组织切除术适应证广,术后近期治疗效果满意,为非均质性肺气肿的治疗提供了一种富有前景的治疗方法。近年来随着微创胸腔镜技术与麻醉技术的迅猛发展,肺减容术有了许多新的术式,不仅降低了手术的死亡率同时也拓宽了手术的适应症,使得更多肺气肿患者有机会接受手术治疗。微创是目前外科医生和麻醉师们共同关注的焦点,减少创伤、缩短手术时间和患者快速康复都将是以后肺减容术发展的方向。近年来不断涌现出许多新的观点和手术方式,如微创腔镜手术、纤支镜腔内肺减容等,均显示出了较好的效果,相应扩大了COPD的可手术范围。但纤支镜腔内肺减容术因内镜支架价格昂贵,肺叶间支气管交通支的存在以及置入物的炎性感染,分泌物未能有效排出,甚至置入物呛咳、移位等尚待改进与完善,故暂时未能有效推广。随着微创胸腔镜技术的不断发展与推广,使肺减容术创伤更小,手术时间更短。快速康复外科是一种新的外科理念,其实质是利用现有手段将围术期各种治疗措施加以改良并重新进行优化、组合,主要包括优化麻醉方法,微创技术及术后镇痛与康复。因此,如何优化麻醉方法与微创技术重新组合将是我们胸外科研究的热点问题。近年来,国外不少文献报道,机械通气的患者由于大剂量应用神经肌肉阻滞药物,可导致一段较长的时间内出现肌无力或肌力短期内无法恢复,因此又补迫继续延长呼吸机辅助通气的时间。为避免上述情况的发生,有学者提出尽可能地将自主呼吸结合进麻醉方式中。自主呼吸麻醉下胸腔镜手术,其定义是在维持自主通气状态下,给予经过轻微镇静实施的胸腔镜手术。其基本原理是避免了基础麻醉下的气管插管的单肺机械通气以及维持了肌肉、神经和心肺的生理状态。与此同时,因术中保持自主呼吸状态避免使用肌肉松弛药物,从而最大限度减少手术及麻醉相关的创伤,自主呼吸发挥更大的作用,避免机械通气、缩短卧床时间,尽可能的减少花费以及使病人更多获益。与此同时,自主呼吸麻醉技术与气管插管相比较,能减少气管插管带来的各种炎性损伤是其最大的优势之一。因此,我们认为在适当的条件下开展自主呼吸麻醉VATS肺减容术不仅能在疗效上与传统手术无差别,同时还能减少患者创伤,缩短了患者住院时间,减轻患者的医疗费用。但其具体的手术适应症、禁忌症及对心肺功能和气道炎症的影响仍在探索和研究阶段。国内外学者纷纷通过构建肺气肿动物模型,以期进一步深入探讨并为开展外科肺气肿治疗提供理论基础。但是,国内目前较少有相关的外科动物实验研究报道。国内多根据不同实验目的需要,实验对象为小鼠、地鼠、大鼠、豚鼠、兔等,但均为小型动物模型,外科可操作性差,所使用或复制的肺气肿动物模型多为均质性肺气肿模型,不能同时达到基础研究的要求及满足临床应用的需要。国内非均质性肺气肿大型动物模型罕见报道,国内外至今也尚未见自主呼吸麻醉肺减容术基础研究的相关报道。目的：本研究以一种可行、安全的方法构建理想的非均质性肺气肿大型动物模型,并通过建立包括系统的生理学与影像学等多项指标的评估方法,对所构建的非均质性肺气肿动物模型进行评估。同时,我们选用此模型开展自主呼吸麻醉肺减容术,过程全面引入了经典呼吸动力学研究方法,真实反映自主呼吸麻醉肺减容术的呼吸生理变化及对机体心肺功能的影响。本研究拟在动物实验的基础上,在病理学、影像学、分子生物学等方面,观察气管、细支气管末梢肺泡在气道炎症反应及其改变,了解自主呼吸麻醉对非均质性肺气肿犬气道炎症的影响。最后,为下一步自主呼吸麻醉下外科肺减容术的系统研究提供实验的理论依据,为临床自主呼吸麻醉肺减容技术的推广与应用提供基础支持。研究方法：为探讨自主呼吸麻醉肺减容术对非均质性肺气肿犬呼吸生理和气道炎症的影响,本课题以自主呼吸麻醉肺减容术为中心,从以下几个方面进行深入研究：1、应用纤维支气管镜技术于靶区肺组织区域滴注木瓜蛋白酶以及联合通气技术确保非均质性肺气肿靶区形成,动物模型顺利构建并通过系统的生理学与影像学进行评估,筛选出理想的动物模型,以满足自主呼吸麻醉肺减容术外科应用基础研究的需要。2、我们运用纤支镜技术置入多导食道-胃电极压力球囊检测管,采用经典的呼吸力学数据获取的研究方法,通过流量、容量、压力测定,膈肌肌电的变化情况,在各时间点对呼吸力学,血流动力学,气体交换及肌电生理学等进行全面地评估,系统地获取呼吸生理学基本的生理指标,真实反映自主呼吸麻醉下肺减容术的呼吸生理改变与影响。各时间点取开胸前15分钟(T1)、开胸时(T2)、开胸后术程20分钟(T3)、关胸后15分钟(T4),关胸后90分钟(T5)。3、上述实验完成后,留取标本,通过常规光镜和电镜检查了解病理学改变,以及酶联免疫吸附实验、实时荧光定量PCR检测不同组织炎性细胞因子的改变,客观反映自主呼吸麻醉肺减容术气道炎症的反应以其改变。结果：第一部分犬非均质性肺气肿模型的构建及系统评价实验组构建犬非均质性肺气肿模型后,通过系统的生理学、影像学、病理组织学进行综合评估。1、影像学(1)胸片示：靶区肺组织密度显著减低,肺野透光度明显增强,呈典型的肺气肿影像学改变。(2)CT扫描检查显示：靶区肺组织密度降低,见形成肺气肿区,余肺野良好,未见明显感染或胸积液形成(3)胸腔镜探查胸腔镜下表现：实验组非均质性肺气肿犬造模成功后,纵隔居中,胸腔动度正常,纵隔胸膜未见炎性渗出,与其它肺叶相比较,靶区肺叶肿胀弹性稍减弱,胸腔未见明显积液,胸膜腔未见炎性粘连,未见脓胸的形成,适合开展外科手术。(4)定量CT示：计算靶区肺组织的CT值符合肺气肿改变,通过显示区域内泡性肺气肿面积及其所占比例,评估并明确靶区形成非均质性肺气肿。2、病理组织学(1)靶区肺组织的大体表现：实验组靶区肺体积较正常对照组增大,肺弹性较差,剖胸后靶区肺体积不萎陷,大部分仍呈肺膨胀饱满状态。靶区肺边缘钝圆,肺组织柔软而缺少原有弹性,指压后肺未能凹陷,可有压痕而渐恢复膨胀,可见有局部区域脏层胸膜下气腔增大。(2)光镜下表现：造模成功后镜下见肺组织较稀疏,肺泡间隔变窄,肺泡腔内可见毛细血管受压,并见断裂或部分消失的肺泡间隔,部分由若干肺泡融合成肺大泡,呈典型肺气肿病理表现。弹力纤维减少,部份中断,肺泡形成,肺泡间隔变薄。(3)肺泡形态学定量分析：实验组与对照组比较,靶区肺叶平均肺泡数(Na)指标显著减少(P<0.001)。(4)电镜下表现：实验组的Ⅱ型肺泡细胞增生,表面微绒毛变短线粒体部分空泡化、肿胀,气道壁见粗大的胶原沉积,板层小体有排空现象。3、呼吸生理学(1)生活习性,日常活动：实验组造模前后比较,犬鼻子油光亮度同造模前,皮毛润泽与造模前无明显改变。日间活动较造模前明显减少,呼吸较促,活动后加重,出现间断咳嗽,偶有喘息出现。(2)血气分析：实验组与对照组造模后比较,实验组自身造模前后比较,血气分Sa02显著降低(P<0.001), PaCO2显著增加(P<0.001)。第二部分自主呼吸麻醉肺减容术对非均质性肺气肿犬心肺功能的影响本研究旨探索自主呼吸麻醉下肺减容术对非均质性肺气肿犬心肺功能的影响,在呼吸力学,血流动力学,气体交换及肌电生理学等进行全面地评估,系统地获取呼吸生理学基本的生理指标。1、呼吸相关力学间接反映胸腔内压的食道内压(Pes)在两组里,T5时实验组绝对值大于对照组(P<0.001)。两组跨膈压(Pdi),于T5时间点两两相比较,实验组绝对值大于对照组,有显著性差异(P<0.001)。两组Pga于T4时未见显著性差异(P=0.127),在T5时两组比较,实验组大于对照组,结果有统计学差异(P<0.001)。两组潮气量(Vt)于T2和T3时间点相比较,实验组小于对照组(P<0.001),但于T5时间点相比较,实验组大于对照组,且两两比较有显著性差(P=0.002)。呼吸频率(RR)于T5时间点,实验组与对照组对比,实验组大于对照组,差异有显著性(P<0.001)。两组肺减容术后,于T4和T5时间点相比较,肺弹性阻力,对照组大于实验组(P=0.003)；肺顺应性,对照组绝对值小于实验组(P=0.003)。2、膈肌肌电膈肌电电压的均方根(RMS),实验组于T2-T3均反映有膈肌肌电活动,而对照组T2-T3基本无明显膈肌电生理活动；两组RMS,分别于T4和T5时间点比较,实验组大于对照组,且均有显著性差异(P<0.001)。3、血流动力学术毕T5时,两组每搏量(SV),两两比较均无显著性差异(P=0.330)；容量管理的血管外肺水指数(ELWI),两两比较均无显著性差异(P=1.000)；心率(HR)指标,两两比较均无显著性差异(P=0.128)。4、血气分析两组比较,当T2、T3时,对照组PaCO2较实验组低,差异有显著性(P<0.001)；与此同时,实验组T4关胸后PaCO2能较快地下降,两组T5的PaCO2比较,实验组较对照组显著性降低(P<0.001)。第三部分自主呼吸麻醉肺减容术对非均质性肺气肿犬气道炎症的影响本研究拟在前期动物实验的基础上,在病理学、影像学、分子生物学等方面,通过对气管、细支气管末梢肺泡在气道炎症反应以其改变进行观察,了解自主呼吸麻醉下肺减容术对非均质性肺气肿犬气道炎症的影响。1、病理组织学无论光镜及电镜下表现：对照组：肺泡结构保存,肺泡间隔血管充血,间质及小血管周围散在淋巴细胞浸润。细支气管管壁周围有炎症细胞浸润,有粘液渗出到细支气管管腔中。实验组：肺泡结构保存,肺泡间隔轻度充血,间质仅见个别散在淋巴细胞浸润,少见炎性细胞。两组肺损伤评分,实验组低于对照组。2、分子生物学(1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、肺泡灌洗液(BALF)、肺组织及气管组织IL-8、TNF-α含量血清内炎症细胞因子的含量与肺组织内、BALF炎症细胞因子变化趋势符合一致。开胸后,两组血浆因子相比较,对照组TNF-α高于实验组,有显著性差异(P=0.025),而两组IL-8在开胸后相比较,无明显变化(P=0.389)。术程毕,关胸后对照组血浆细胞细子TNF-α与IL-8,均高于实验组,有显著性差异(P<0.001)。与此同时,关胸后BALF、肺组织、气管组织细胞因子变化趋势相符,关胸后对照组均大于实验组,有显著性差异(P<0.001)。(2)实时荧光定量PCR检测肺及气管组织TNF-α和IL-8蛋白表达两组动物肺组织中的TNF-α和IL-8的表达不同。相关基因相对表达水平检测,实验组的TNF-α和IL-8比对照组的TNF-α和IL-8表达上调,两两比较,差异有统计学意义,实验组小于对照组(P<0.001)。3、PET/CT影像学影像学PET/CT评估结果提示,随着时间的推移,影像学气管插管后气道炎性损伤的4小时后才开始呈现,气管插管组表现为气管腔内壁可见环形区域代谢增高。自主呼吸组气管腔内壁未见明显代谢增高。结论：1、本研究结果表明应用木瓜蛋白酶,运用纤支管镜技术并合理地使用辅助通气,可构建出理想的大型动物非均质性肺气肿模型,其操作简单,实验成本低,周期较短,重复性好,能在短周期内构建出一种可操作性强,同时满足基础研究和临床应用研究所需要的大型动物非均质性肺气肿模型,方法可行、安全、有效。2、通过对自主呼吸麻醉肺减容术心肺功能的影响进行系统的评价和分析,实验结果显示方法可行,同时得出以下结论：(1)自主呼吸麻醉下开展肺减容手术实验方法是可行、安全、有效的。(2)自主呼吸麻醉下开展肺减容手术术程血流动力学影响不大,膈肌肌电未受明显干扰,术后膈肌肌电和呼吸动力恢复较气管插管全麻快。(3)展望自主呼吸麻醉胸腔镜手术最大的获益对象将是：①在血流动力学平稳的前提下,在一定范围内可以耐受适度的低氧血症或／和允许性高碳酸性血症,能通过建立代偿机制平稳度过的患者。②那些可以从“逃脱”肌松残余效应中获益的患者。③同时满足膈肌肌电生理正常触发的患者。3、本研究在外科大型动物手术实验操作全程,建立酶联免疫吸附试验及实时荧光定量PCR方法检测炎性因子的表达,从基础学方面研究肺损伤。同时我们能结合病理学、分子生物学、影像学,综合整体地去了解与分析气道炎症的演变及内在相互间的关系。无论细支气管肺泡还是大气道,自主呼吸麻醉气道炎性反应较气管插管明显减轻。TNF-α为促使炎性介质释放和诱导,在发生炎性反应的组织中其表达较快。而IL-8、TNF-α表达的不同提示IL-8与TNF-α在其致炎性损伤过程中的作用有所不同。