论文部分内容阅读
减蛋综合征(Egg Drop Syndrome,EDS-76)是由减蛋综合征病毒(EDSV)引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病,该病在世界范围内的发生和流行给养鸡业带来了巨大的经济损失。本研究以EDSV京911株为基础材料,经过鸭胚繁毒、提取DNA,并以此为模板,参考GenBank上发表的国际标准株AV-127的全基因序列(序列号AC000004)设计了8对特异性引物,PCR扩增出目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,转化到宿主菌TG1感受态细胞中,经质粒PCR、酶切鉴定以及测序证明,最终得到了该株病毒包含52/55k、Ⅲa、五邻体、pⅦ、pⅩ、pⅥ、六邻体、EP、100k、pⅧ和纤维蛋白的部分基因,共15715bp。将EDSV京911株与其它腺病毒进行核苷酸和氨基酸序列比对,结果显示EDSV京911株与AV-127株高度同源,除纤维蛋白和pⅧ外,其它蛋白的同源性都在99.00%以上,其中五邻体、六邻体、巯基内肽酶、PⅥ和PⅩ氨基酸序列完全一致,由此推论EDSV京911株与AV-127株可能为同一基因型。同时,根据序列比对结果绘制了五邻体、六邻体和巯基内肽酶系统发生树,结果显示EDSV与OAV287和BAdV-4遗传关系最近。根据已获得的京911株核苷酸序列,并参考AV-127株的五邻体、纤维蛋白和六邻体全基因序列,分别设计合成了带有酶切位点的特异性引物,最终克隆得到包括起始密码子和终止密码子在内的完整基因序列。将目的基因通过EcoRI和HindⅢ位点插入到表达载体pET-30a(+),获得的阳性质粒分别命名为pET-30a-Penton、pET-30a-Fiber和pET-30a-Hexon,将阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,结果显示分别得到了大小约54.0ku、69.7ku和110.0ku的重组蛋白,经Western-blotting、琼脂双扩散和Dot-ELISA检测,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性。本研究成功克隆了EDSV京911株部分基因,为构建EDSV载体打下了良好的基础;同时利用原核表达系统成功表达了EDSV的三个主要结构蛋白,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性,为进一步研究EDSV结构蛋白和建立新的EDSV检测方法奠定了基础。