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由于叶酸的稳定性差、具有叶酸生物活性的相关化合物组成复杂且在生物样品中含量很低,因此对叶酸的分析相当困难<7>.高效液相色谱-质谱/质谱联用技术(HPLC-MS/MS)不仅能够快速、高效地分离叶酸(FA)及相关化合物,而且此技术能满足对方法灵敏度的要求,样品用量少,有较好的应用前景.为了定量测定人体血浆中叶酸(FA)及5-甲基四氢叶酸的浓度,本文建立了利用HPLC-MS/MS联用技术的分析方法,定量测定叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸在血浆中的浓度.血浆样品在弱光环境下,经过固相萃取(SPE)萃取等一系列处理后,以甲醇:5mmol/L乙酸铵(pH=6.0)=25:75(v/v)为流动相,利用Waters公司的XTerra MSC18色谱柱进行初步分离,经过电喷雾离子源(ESI)正离子化,在Micromass Quattro Ultima三重四极杆质量分析器上以多反应离子监测(MRM)方式监测目标化合物叶酸(FA)(m/z 442.20→295.20)、5-甲基四氢叶酸(m/z 455.23→308.00)和内标(m/z460.23→313.00)的正离子,使用MassLynx 3.5的工作站软件进行定量计算.实验结果显示,本法对游离叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸的最低定量限都为0.5ng/mL.在方法建立的过程中,采用加入抗氧剂、避免高温和使用弱光环境等措施尽可能地克服待测物不稳定带来的问题.在多种色谱柱里挑选更合适的HPLC色谱柱,确定流动相的组成和流速.在建立SPE样品制备方法的过程中,选择了Waters公司的Oasis MAX(30mg)SPE萃取柱,最终使用含抗氧剂的2%甲酸抗氧甲醇溶液作为洗脱液.根据实验结果和考虑实验需求,选用pH=8.0的5mM乙酸铵溶液作为复溶液,这样尽可能多地溶解待测物,同时不会造成流动相与复溶液pH差别太大.在特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、回收率、稳定性等方面对本方法进行了严格的方法学评价.方法学考核的结果显示此法可定量测定生物样品中叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸的浓度.使用该方法定量分析了47名健康人、73名冠心病(CAD)患者和39名高血压(HTN)患者血浆中叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸的浓度.发现CAD患者和HTN患者血浆中5-甲基四氢叶酸水平较健康人的水平明显降低,说明5-甲基四氢叶酸水平低下可能与CAD和HTN相关.