研究背景结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病。结核病历史悠久,在七千多年前的新石器时代的人类骨化石上就被发现有脊柱结核的踪影。结核分枝杆菌可以侵犯许多器官,最常见的是肺结核,它是危害人类健康的重要疾病之一。世界卫生组织(WHO)2016年全球报告统计,在2015年全世界大约有10,400,000例新发结核病患者,我国有918,000例,其中女性296,000例,男性622,000例,其病死率为4%。近些年来,随着流动人口的增加,我们在结核菌病治疗方面又遇到了两大较为突出的难题,那就是耐药结核病和结核病伴有HIV感染患者的治疗。2015年我国数据显示已知耐多药肺结核(MDR-TB)和耐利福平肺结核(RR-TB)患者约57000例,结核病伴有HIV阳性患者10034例,而接受正规治疗的有3750例,仅占37%。这两类患者不仅治疗费用昂贵,而且治疗效果差,且易引起传播,是目前结核病防治的重点。我国是全球结核病负担较重国家之一,在相当长时间内排名一直居于第二位,2015才降为第三位,一方面说明了我国政府对结核病的重视和投入,并收到了一定的效果,另一方面也说明了我国结核病疫情的严峻性。在2016年中国政府投入结核病的经济花费大约为3720万美元,折合人民币约为大约250080万,这对于我国来说是个庞大的经济负担。糖尿病和肺结核一样都是严重威胁人类健康的慢性疾病。随着人们生活饮食方式的变化,比如更多的年轻人作息不规律、熬夜、饮食不健康、久坐、活动减少,以及老龄化人口增多、肥胖症患者的增加,糖尿病的发病率逐年增高。2015年国际糖尿病联盟(IDF)在糖尿病全球报告里详细展示了目前全球糖尿病患病情况和经济负担。2015年全球糖尿病患者人数高达4.15亿,患病率为8.8%。其中75%的患者分布在中低收入国家。估计2040年全球糖尿病患者数将达6.42亿,患病率将上升至10.4%(大致范围8.5%-13.5%)。2015年中国糖尿病患者数是1.096亿,居全球首位。根据2013年到2015年的发展速度,估计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿。在2015年,全世界用于糖尿病治疗及并发症预防的费用达6,730～11,970亿美元,占全球医疗支出的11.6%。预计到2040年,与糖尿病相关的全球医疗费用将达到8,020～14,520亿美元。糖尿病患者感染肺结核的风险是普通人群的3倍。主要原因可能与糖尿病患者糖、蛋白、脂肪代谢紊乱,使得患者的营养状态变差,抵抗力下降,同时受损组织的修复能力越来越差,长期处于一种免疫力低下的状态。同时血液及组织内糖量增多,甘油产物的蓄积,是细菌的良好培养基,而肺部血容量丰富,亦有利于结核菌的生长繁殖。患有结核病的糖尿病患者的血糖往往偏高,难以良好控制。而在患糖尿病的肺结核患者中,经过抗结核治疗后,血糖会随着治疗的时间逐渐下降,部分在发现肺结核时确诊的糖尿病患者在抗结核治疗结束后血糖可降至正常。所以糖尿病和肺结核的发生互相影响,存在互为因果的关系,并互相影响治疗效果。近年来,在全球结核病得到良好的控制的趋势下,糖尿病肺结核患者却在逐年增加。在肺结核合并糖尿病患者高发国家中,中国排在第二位。2012年数据显示,我国成人活动性肺结核患者中糖尿病患者占17%,肺结核合并糖尿病患者达156000人。这不仅是一个值得高度重视和关注的医学问题,也是一个牵涉面广、影响巨大的经济和社会问题。所以无论是政府,还是社会层面,以及医学专业要求,若要更加有效预防控制肺结核,糖尿病控制必然是我们需要关注的重点。2016年的全球报告中并没有诊断技术方面新的突破。目前我们虽然有许多的结核病的诊断和监测方法,但是都存在一些不足。有些方法特异度偏低,有些敏感度偏低,有些方法仍然需要较长时间,譬如结核菌培养,需要20-30天,再加上药物敏感试验仍再需要40多天,在结果没有出来之前,我们只能根据临床经验用药;判断疗效我们常用的胸部影像学检查,因对身体有辐射,不能频繁检查,等等,这很难满足临床的实际需要。近些年来,关于microRNA的研究越来越多。MicroRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA,位于基因组非编码区,在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用,长度为18～25核苷酸。由60～110nt的可以形成发夹状的内源性转录前体加工而成。最近的一些研究证明,miRNA可以作为某些疾病早期诊断的生物学标记,包括胃癌、肠癌以及呼吸系统疾病、心血管系统疾病以及某些产前诊断。尽管它的长度较短,但是可以影响很多蛋白的表达,在靶基因降解或抑制蛋白翻译过程中,起调控基因表达的作用。所以,作为某些疾病的生物学标记,miRNA显示出高度的特异性。在miRNA的研究中,与肺结核和糖尿病相关的miRNA也有一些前期研究。有人发现在结核分枝杆菌和宿主细胞之间,部分miRNA可以特异表达并起到重要的调节作用,比如miR-223、miR-144、miR-421。在糖尿病患者中发现影响胰岛素表达的有miR-30d,mmiR-375,miR-124a2;影响胰岛素分泌的有 miR-375,miR-9,miR-124a2,miR-144。众多文献发现,miR-144在结核病患者中表达上调,并且能在患者的血清、痰液和胸腔积液中均能检测到。所以本文选择miR-144进行研究。miR-144在其他的许多领域已经有众多的研究,比如miR-144是红系分化的重要调控因子,参与了许多癌症的发病,包括结肠癌、胰腺癌、喉癌、恶性间皮瘤、骨肉瘤的发病。参与脊髓共济失调和阿尔兹海默病病理过程。也有研究发现miR-144是促进心肌细胞凋亡的基因之一。此外,也有许多关于其在呼吸系统疾病中的研究,诸如miR-144参与了肺癌、呼吸细支气管炎、病毒性肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺小结节等呼吸系统疾病的调控等。miR-144在结核感染过程中的机制已有众多发现,总结归纳后发现:miR-144主要在T细胞中表达,并参与管理T细胞免疫功能,它能抑制两种主要的免疫因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子-α的产生,所以miR-144能阻止T细胞的增殖,导致结核杆菌病原体清除困难,在结核感染系统扮演了重要角色。在关于糖尿病的研究中发现miR-144不仅仅通过蛋白调控影响胰岛素基因的表达,又能作用于肝脏、脂肪、骨骼肌等胰岛素的靶受体。胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)是它的靶基因,通过调控IRS1表达的控制因子,使其表达下调,从而影响胰岛素的功能,产生胰岛素抵抗。miR-144在糖尿病患者的外周血中明显升高,所以miR-144可以作为一个糖尿病生物学标记物。基于以上考虑,我们来做这项研究,进一步探讨miR-144在肺结核病和肺结核合并糖尿病的诊断和疗效评价中的应用价值。研究目的1.观察肺结核病患者治疗前后痰液及血清mmiR-144水平变化,探讨miR-144在肺结核患者中的诊断价值。2.观察肺结核合并糖尿病患者与无糖尿病患者痰液及血清miR-144水平变化。3.观察miR-144与γ-干扰素的水平变化之间的关系,对miR-144参与结核感染过程机制进行探讨。研究方法收集124例肺结核病患者入实验组,分为A、B、C三组。其中,A组为痰菌阳性伴有空洞患者,共53例;B组:为痰菌阴性伴有空洞患者,共20例;C组:为痰菌阴性无空洞患者,共51例。124例肺结核患者中有糖尿病患者53例,无糖尿病患者71例。两组的年龄和性别均无显著性差异(P值均>0.05)。治疗6个月后,124例患者中失访17例,剔除10例,其中5例出现肝功能损害;3例出现白细胞显著减少;2例出现药物性皮疹。同时,选取117例健康体检患者为对照组。所有患者在治疗前和治疗后1个月、治疗后6个月检测痰液和血清miR-144水平。在治疗前和治疗1个月后行胸片或者胸部CT检查、血清γ-干扰素以及评估病情变化。病情变化的判断指标:(1)病情好转是指患者临床症状改善,并痰结核菌涂片转阴,胸部CT显示病灶吸收至少1/3,空洞关闭或者收缩至少1/3;(2)病情无好转是指患者临床症状无明显改善,痰结核菌涂片仍然为阳性,胸部CT显示病灶吸收少于1/3,空洞没有变化或者较前增大。其中临床症状指:咳嗽、咳痰、发热、盗汗、呼吸困难、胸痛。健康对照组在体检当天进行痰液和血清miR-144、血清γ-干扰素的测定。使用实时定量酶链反应技术(RT-PCR)检测痰液和血清的miR-144含量,使用ELISA方法测定血清γ-干扰素含量。统计方法:数据统计分析使用SPSS19.0软件。计量资料使用x± s。配对计数资料使用卡方检验。抗结核治疗前和治疗1个月后痰液和血清miR-144的比较使用配对样本t检验,组间治疗效果比较使用独立样本t检验。P<0.05认为其差异性具有统计学意义。相关性研究采用双变量Person相关分析。ROC曲线被用来评估诊断效果。ROC曲线下的面积(AUC)计算评估痰和血清miR-144的诊断效果。P值<0.05认为具有统计学意义。结果1.总体比较1.1 治疗前肺结核患者的痰液和血清miR-144均比对照组高(P均<0.001);1.2 治疗1个月后肺结核患者的痰液和血清miR-144均较治疗前显著下降(P均<0.05);治疗6个月后痰液和血清miR-144较治疗1个月时显著下降(P均<0.05)。1.3 治疗6个月后肺结核患者的痰液和血清miR-144仍然高于健康对照组(P均<0.001)。2.实验组A、B、C三组组间比较2.1 治疗前痰液和血清miR-144水平比较:A、B、C组均高于对照组;A组高于B组和C组,B组高于C组(P均<0.05)2.2 治疗1个月后痰液和血清miR-144下降水平比较:A组及B组均下降显著(P均<0.05),C组下降不明显(P>0.05)。2.3 治疗1个月后痰液的miR-144水平比较:A和B组均显著高于C组及对照组(P均<0.05)。然而C组治疗1个月后与对照组比较,痰液的miR-144无显著差别(P>0.05)。治疗1个月后血清的miR-144比较:A、B、C三组均高于对照组(P均<0.05)。2.4 治疗6个月后,在痰液组,A组和B组之间、C组与B组比较差异无明显差异(P均>0.05),A组比C组明显偏高(P<0.05);在血清组,A组和B组之间、C组与B组之间、A组与C组之间比较无明显差异(P均>0.05)3.病情好转组和病情无好转组比较3.1病情好转的患者在治疗后痰液和血清miR-144的表达是显著下降的(P均<0.001)。3.2 病情无好转的患者治疗后痰液和血清miR-144的表达无显著变化(P>0.05,P=0.891)。3.3 治疗1个月后A、B、C三组病情好转患者以及A组病情无好转患者痰液和血清miR-144均显著下降(P均<0.001)。3.4 C组病情无好转的患者,痰液和血清miR-144是上调的(P均<0.05),而B组病情无好转的患者,痰液和血清miR-144无明显变化(P 均>0.05)。4.特异度和敏感度测定4.1 痰液 miR-144ROC 分析显示 AUC 是 0.954(95%CI(0.925,0.983),P<0.001)。当 cut-off 值为 1.185,敏感度为86.29%,特异度为99.15%,均为最高点。4.2 血清 miR-144ROC 分析显示 AUC 是 0.997(95%CI(0.993,1.000),p<0.001)。当 cut-off 值为 0.848,敏感度为99.19%,特异度为94.87%,均为最高点。5.无论是治疗前还是治疗1个月后,肺结核合并糖尿病组患者的痰液和血清miR-144水平均比无糖尿病肺结核组显著升高(P均<0.01)6.治疗后痰液和血清miR-144下降水平在肺结核合并糖尿病组和无糖尿病肺结核组之间比较:A组与B组、C组比较均有显著差异(P均<0.05);B组和C组比较无统计学差异(P>0.05)。7.γ-干扰素在健康对照组、实验组(A、B、C三组)治疗前、治疗1个月后差异有显著性(P均<0.05)。8.实验组(A、B、C三组)治疗前和抗结核治疗1个月后miR-144与γ-干扰素呈负相关(P均<0.05)。结论1.本实验的ROC曲线结果证明无论是痰液和血清miR-144在肺结核病的诊断方面都有很高的灵敏度以及特异度。这表明miR-144可以作为肺结核病的辅助诊断指标。2.实验组患者较健康对照组痰液及血清miR-144水平是显著上调的;但是在抗结核治疗1个月以及6个月后会显著下降。表示miR-144随着结核病治疗的好转是逐渐下降的。3.抗结核治疗前痰液和血清miR-144检测结果提示,A组显著高于B组、C组,B组显著高于C组,表明miR-144在痰涂片阳性并伴有空洞的严重肺结核患者中显著偏高,能判断结核病的严重程度。4.在治疗1个月后:病情好转组患者,治疗前后痰液和血清的miR-144下降明显;病情无好转组患者,治疗前后痰液和血清的miR-144无明显差别,可以再次证明在抗结核治疗有效后miR-144是有显著下降的。5.肺结核合并糖尿病组无论在治疗前还是在治疗1个月后,痰液和血清中的miR-144均比无糖尿病肺结核组高。6.miR-144对γ-干扰素进行负性调控。