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目的采用前瞻性研究方法,利用差异蛋白质组学方法研究阴囊短暂热激前后人精子蛋白表达,发现热激导致生精障碍的关键蛋白,为男性不育的诊断和治疗提供新的思路。方法招募10名健康男性志愿者,随机编号分两组,取43℃温水温浴前及温浴后第6周(精液常规参数最差)精子标本,采用iTRAQ技术进行标记,结合2DLC-MS/MS对两组精子总蛋白进行分析,运用Quick GO、KEGG Pathway数据库对差异蛋白进行分子功能、生物过程及代谢通路进行富集分析,运用STRING数据库结合其分子功能、代谢通路等绘制差异蛋白质的网络关系图。然后通过Western blot方法检测小鼠附睾尾部精子ODF2、ODF1和ACTRT2蛋白表达验证组学结果,并通过免疫荧光和组织化学方法对其功能进行初步研究。结果1.以FDR≤1.0%,具有一条及一条以上可信度在95%以上的肽段为标准,鉴定出3446种可信蛋白。2.筛选出61种差异表达蛋白,其中表达上调的有28种蛋白,表达下调的有33种蛋白。3.生物信息学富集分析显示:发现的61种差异蛋白,共参与367种生物过程,其中主要参与有性生殖、受精、配子形成、精子运动、细胞发育、精子分化、RNA定位等10种主要生物过程;61种差异蛋白主要参与细胞内细胞器、核糖核蛋白复合体、细胞浆、鞭毛、胞膜吞吐囊泡等10种主要细胞组成成分;61种差异蛋白主要表现参与核酸、功力蛋白、未折叠蛋白等结合、激活核苷酸活性等10种分子功能;KEGG代谢通路注释分类,有19种有差异的蛋白质参与mRNA剪接、碳水化合物的消化和吸收、葡萄糖的产生、果糖、甘露糖代谢、甲状腺激素合成等9条代谢途径。4.小鼠附睾精子ODF2、ODF1和ACTRT2蛋白Western blot验证结果与组学结果一致。5.ODF2和ODF1蛋白定位在小鼠精子尾部,热激处理前后,表达位置不发生改变;在小鼠睾丸组织中,ACTRT2和ODF1定位于精母细胞、支持细胞和圆形精子;ODF2定位于圆形精子及精子细胞,热激前后表达位置不发生变化。结论1.差异表达蛋白相互作用和功能聚类分析发现,61种差异蛋白中26种蛋白形成2条独立相互作用网络关系,剩余35种蛋白不参与相互作用;61种表达差异蛋白主要构成细胞内细胞器、核糖体蛋白复合体和鞭毛,参与有性生殖、受精、精子运动和细胞发育等生物过程,表现与核酸和蛋白结合的分子功能;但与热激影响精子发生的原因还有待进一步研究。2.ODF2、ODF1和ACTRT2蛋白表达下调,与热激破坏精子发生有关,有望成为诊断和治疗男性不育新的靶标,同时为男性避孕提供新的思路。