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博来霉素(Bleomycin,BLM)是一种氨基糖苷类天然产物,由梅泽宾夫等于1966年从轮枝链霉菌的培养液分离得到,至今临床应用已经50余年,抗癌活性强,尤其对淋巴癌、磷状细胞癌、肺癌和生殖系统癌症具有很好的疗效,同时无明显的骨髓抑制,不抑制机体的免疫功能,使其成为临床肿瘤化疗的重要药物,但其严重的肺纤维化毒副作用,极大的限制了临床足量足疗程应用。因此如何在保证BLM足量足疗程应用的基础上,防治肺纤维化是进一步改善肿瘤患者预后的关键。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是运用酵母双杂交技术鉴定获得的一种具有蛋白激酶活性的新蛋白质,在多种生长因子信号通路中发挥重要作用,活化后的ILK可以调控其下游的靶标蛋白,进而调控细胞增殖、生长、分化、迁移、浸润以及肿瘤血管生成等过程。上皮细胞-间质转化(epitelial-mesenchymal transition,EMT)是肺纤维化的重要过程,多项研究表明ILK与细胞的EMT密切关联,促进EMT发生发展。活化后的ILK介导α-平滑肌蛋白表达上调,从而参与EMT的形成。新近研究发现Wnt信号通路同样可以参与多器官的纤维化过程。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号转导系统是肺部发育所必需的分子信号系统,其表达异常与肺纤维化亦密切相关,该通路参与纤维化主要与β-连环蛋白的核聚集相关。当β-catenin磷酸化被抑制时,导致其无法被泛素识别,从而不能被蛋白酶复合体降解,进而在细胞质内大量集聚并发生核聚集,导致组织纤维化。新近研究发现β-catenin与ILK存在重要对话:β-catenin的核聚集与糖原合成激酶3β(Gkycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)的磷酸化有关,同时Virchows等研究表明,活化后的ILK亦可以影响GSK-3β的磷酸化,因此二者在肺纤维化中可能存在协同作用。肺纤维化是一种进行性加重的间质性肺部病变,病理表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化,其确切发病机制仍不清楚。大致为化学或其他原因触发肺部炎症,随后出现渗出、纤维母细胞增殖以及细胞外基质蛋白沉积,最终导致不可逆性肺损伤,目前虽然仍无特性药物治疗,但国内外一个重大突破发现,大环内酯类抗生素能够阻止纤维化疾病发展,甚至可以改善肺功能。何坤等研究发现,红霉素可以预防博来霉素导致的肺纤维化。牛晓娟等研究发现阿奇霉素能够减轻肺纤维化大鼠模型中胶原沉积,具有与地塞米松相似的作用,且不良反应少。但大环内酯类抗生素抗纤维化的具体机制仍处于探索之中。目的:本文通过博来霉素复制小鼠肺纤维化模型,予阿奇霉素干预,观察小鼠肺组织病理改变及ILK和β-catenin含量变化,探讨阿奇霉素在肺纤维化中的作用,并为临床应用提供理论依据。方法:选取清洁级健康昆明小鼠100只,体重18-22g,适应性饲养1周后,随机分为A组(模型组):20只,气管内一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理盐水溶解),于造模后第1天生理盐水1ml灌胃,1次/d,共28天;B组(空白组):20只,气管内注入1ml生理盐水,于假造模后第1天生理盐水1ml灌胃,1次/d,共28天。C组(阿奇霉素干预组Ⅰ):20只,气管内一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理盐水溶解),于造模后第1天给予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理盐水溶解)灌胃,1次/天,共14天。D组(阿奇霉素干预组Ⅱ):20只,气管内一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理盐水溶解),于造模后第15天给予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理盐水溶解)灌胃,1次/天,共14天。E组(阿奇霉素干预组Ⅲ):20只,气管内一次性注入BLM(3.5mg/Kg,以1ml生理盐水溶解),于造模后第1天给予阿奇霉素5mg/Kg(1ml生理盐水溶解)灌胃,1次/天,共28天。以上各组分别于7、14、21、28天各处死5只。剪断右侧股动脉放血处死,处死后即刻取右肺匀浆,置于-70℃冰箱中,待标本收集完成后,运用ELISA测定ILK、β-catenin蛋白含量。左肺组织放于4%甲醛固定液后做HE染色及Masson染色,评价肺泡炎症和肺纤维化的程度。统计学分析:应用SPSS17.0统计软件包对实验数据进行处理,计数资料采用均数±标准差(X±SD)表示,同一时间点,同一指标的组间比较在满足正态性及方差齐性下进行独立样本T检验,不满足正态性或方差齐性情况下进行独立样本的非参数检验,两变量相关采用Spearman等级相关分析,以P<0.05为检验标准。结果:1肺组织病理结果分析:在相同时间点,A组小鼠肺泡炎及纤维化程度均显著高于B组;C组和E组小鼠肺均有轻度肺泡炎及纤维化,两组与A组比较,小鼠肺泡炎及纤维化程度均显著减轻;D组小鼠肺组织实验第7天及第14天可见与A组相同时间点同样程度的肺泡炎症及纤维化,给予阿奇霉素干预后,即第21天及第28天D组小鼠肺组织炎症及纤维化较A组相同时间点明显减轻。各组病理结果表明肺纤维化分为早期炎症及晚期纤维化两个阶段,符合人肺纤维化病理过程,且炎症反应随纤维化进展逐渐减轻,而纤维化程度逐渐加重。2肺组织中ILK、β-catenin含量:2.1组间比较1)相同时间点:A组小鼠肺组织中的ILK、β-catenin含量较B组均明显升高,尤以A组第28天升高最为显著,差异均有统计学意义(P均<0.05);2)相同时间点:C组小鼠肺组织中的ILK、β-catenin含量较A组均明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05);3)相同时间点:D组小鼠肺组织中ILK、β-catenin含量在第7天、第14天较A组无明显变化,差异均无统计学意义(P均>0.05);在第21天、第28天肺组织中ILK、β-catenin含量较A组均明显下降,差异均有统计学意义(P均<0.05);4)相同时间点:E组小鼠肺组织中ILK、β-catenin含量较A组均明显下降,差异均有统计学意义(P均<0.05);5)相同时间点:C组小鼠肺组织中ILK、β-catenin含量较E组均无明显变化,差异均无统计学意义;2.2组内比较1)不同时间点:A组小鼠肺组织中ILK、β-catenin含量随时间延长逐渐增加,差异均有统计学意义(P均<0.05);2)不同时间点:B、C、E三组中,小鼠肺组织ILK、β-catenin含量均无明显变化,差异均无统计学意义(P均>0.05);3)不同时间点:D组小鼠肺组织中ILK、β-catenin含量在阿奇霉素干预前后均有差异,即D组小鼠肺组织ILK、β-catenin含量在第7天、第14天与第21天、28天比较均明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。3肺组织中ILK、β-catenin的相关性分析:不同时间点A组博来霉素模型组中,小鼠肺组织ILK、β-catenin的含量较B组空白组小鼠肺组织ILK、β-catenin的含量均明显升高,二者呈正性相关,具有统计数意义(P<0.001,r=0.978)结论:1阿奇霉素可以阻断博来霉素致小鼠肺纤维化发生、进展,可能成为临床解决肿瘤患者应用博来霉素致肺纤维化的防治方法。2阿奇霉素干预小鼠肺纤维化的效果与用药时机及药物疗程有关,于肺纤维化早期炎症阶段效果显著,对小鼠肺纤维化后期纤维化阶段也存在一定效果。3 ILK、β-catenin均参与肺纤维化过程,二者存在正性相关,提示二者在纤维化过程中可能存在协同作用。