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目的:猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）与严重呼吸综合征病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2,SARS-Co V-2）同属于套式病毒目,具有相似的基因组结构以及感染与复制机制。套式病毒目病毒核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,N protein）及其携带的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）对病毒的转录与复制具有非常重要的意义。本文的第一部分内容对病毒的全基因组扩增及测序,应用分子流行病学方法分别对PRRSV流行野毒株及多次传代后的流行代表毒株基因重组及突变情况进行分析,旨在深入了解套式病毒目病毒基因组重组及突变的模式,从而为该类疾病的防控提供重要依据。以第一部分研究发现为基础,本文第二部分内容首次针对N蛋白NLS区自然突变对该类病毒N蛋白核质穿梭以及病毒基因转录、复制带来的影响进行研究,旨在解析NLS区自然突变对该类病毒核质转运机制的影响,从而为抗病毒药物靶点的筛选提供新的思路和依据。方法:从发生的高致病性PRRS事件病猪的病变组织中进行病毒的鉴定与分离。应用Primer5.0分段设计全基因组扩增引物,采用RT-PCR方法分段对流行野毒株及多次传代后的流行代表毒株的基因组进行扩增,后经连接、转化获取阳性克隆,提取阳性质粒送生物公司测序,拼接获取PRRSV全基因组序列。从Gene Bank中下载PRRSV经典代表株全序列,分别应用RDP4、SIMPLOT等分子流行病学分析软件对流行野毒株及多次传代后的流行代表毒株的全基因序列进行重组性及SNP分析。以PRRSV经典毒株（NLS未突变）、HP-PRRSV疫苗株（NLS突变）、HP-PRRSV流行代表毒株（NLS突变）为研究对象,应用病毒空斑实验确定病毒滴度,以MOI=0.1感染Marc-145细胞,首先应用Western-blot方法从蛋白水平分别对三株病毒感染48小时内（20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h）N蛋白的表达情况进行监测,分别针对不同毒株同一时间以及同一毒株不同时间内N蛋白的表达差异性进行统计学比较与分析;以MOI=0.1感染Marc-145细胞,采用细胞免疫荧光实验对三株病毒在48小时内（4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h）N蛋白的定位情况进行监测,针对不同毒株同一时间以及同一毒株不同时间内N蛋白的定位差异性进行比较与分析。三株病毒均以MOI=0.1感染Marc-145细胞,采用Real-time PCR方法对在48小时内（4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h）病毒N蛋白基因的表达情况以及N蛋白入核转运受体α（Karyopherin alpha,KPNA）三个亚型7种受体、入核转运受体β1（Karyopherin beta1,KPNB1）的表达情况进行同步检测,分别针对不同毒株同一时间以及同一毒株不同时间内N蛋白及8种受体的表达差异性进行统计学比较与分析。结果:本研究从临床发病动物组织中分离到一株PRRSV流行野毒株（SD2020）,经RT-PCR扩增、连接、转化、测序、拼接,我们成功获得流行野毒株（SD2020）及多次传代后的流行代表毒株（JXA1 PX）的全基因组序列,其中SD2020全长15386bp（序列提交至Gene Bank登录号:MW408254）,JXA1 PX全长15287bp;基于病毒全基因序列的同源性分析结果中SD2020与PRRSV 2型代表株同源性为94%,与PRRSV1型代表毒株同源性仅为58%,SD2020为PRRSV 2型毒株;基于病毒全基因序列的重组性及SNP分析结果表明SD2020为重组病毒,其基因组由PRRSV经典毒株VR2332以及高致病性HP-PRRSV毒株类JXA1（该类毒株由JXA1演化突变而来,以下简称JXA1-like）毒株CH-YY与15SC2发生重组形成;点突变分析结果表明,JXA1 PX在传代过程中基因序列发生连续性的缺失与突变,PRRSV与HP-PRRSV相比较存在氨基酸位点K46R突变并在JXA1-like毒株中稳定遗传,改变了N蛋白NLS序列。Western-blot监测结果表明所有毒株N蛋白表达量随着病毒感染时间增加而增加,呈现明确的时间效应规律;相比于JXA1-R N蛋白在24hpi已经开始表达、JXA1在32hpi N蛋白开始表达,VR2332在36hpi才开始,且表达效率明显低于同时间段的JXA1-R与JXA1,差异具有统计学意义。细胞免疫荧光实验结果表明,所有毒株在感染48h内,均观察到N蛋白的核质穿梭现象,且在36hpi与48hpi时N蛋白核内定位明显;相比于JXA1-R与JXA1,VR2332 N蛋白表达时间晚、参与核质穿梭的量尤其是细胞核内表达要晚于同时期的JXA1-R与JXA1。Real-time PCR实验结果表明所有毒株随着感染时间的增加,病毒N蛋白基因的表达量也在逐渐增加,呈现明确的时间效应关系,这同时进一步验证了Western-blot与细胞免疫荧光的实验结果。对三株病毒感染过程中8种受体表达情况的实时监测结果发现,其一致性规律为KPNA3、KPNA4、KPNA5在细胞内的表达量并没有随着病毒感染时间的增加及N蛋白基因表达量的变化而变化,与之相比,KPNB1、KPNA1、KPNA2、KPNA6、KPNA7基因表达水平随着病毒感染时间的增加及N蛋白基因表达量的增加而增加;在48hpi时,VR2332中KPNA1、KPNB1基因的表达水平在显著的低于同时期的JXA1以及JXA1-R,差异具有统计学意义。结论:临床流行毒株SD2020发生了基因重组,重组基因分别来自经典PRRSV毒株（VR2332）、HP-PRRSV疫苗株（CH-YY）、HP-PRRSV野毒株（15SC2）;HP-PRRSV流行代表毒株在传代过程中基因序列发生连续性的缺失与突变;HP-PRRSV N蛋白NLS区自然突变导致N蛋白核质穿梭能力增强,其可能的机制是NLS区第46位氨基酸的自然突变导致N蛋白与入核转运受体KPNA1、KPNB1亲和力增加。