目的:气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）是最具致病性的梭菌之一,主要引起气肿疽,也称为黑腿病,该病具有高致死率,在全球范围内造成畜牧业生产的重大损失。气肿疽梭菌细胞毒素（CctA）是其产生的五种毒素中最典型的致病性毒素,具有细胞毒性和溶血活性,是主要的保护性抗原,在致病性中起着主导作用,成为黑腿病疫苗的一个有价值的候选抗原。本试验通过对气肿疽梭菌CctA全长基因进行生物信息学分析,构建截短CctA基因原核表达质粒并诱导蛋白表达,制备亚单位疫苗免疫豚鼠,建立间接ELISA方法检测豚鼠体内抗体水平,对亚单位疫苗的免疫效果进行初步分析。方法:1.根据公布的CctA基因序列设计特异性引物并合成。利用生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA蛋白的结构和功能、糖基化位点、优势抗原表位等进行预测。2.根据生物信息学分析结果,合成CctA全长基因去除信号肽及部分序列的片段。将截短CctA基因经pMD19-T克隆后插入原核表达载体pET-28a（+）,转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞,利用IPTG诱导蛋白表达,并分析其反应原性。3.表达的蛋白经甲醛灭活后与Al（OH）₃佐剂混合配制疫苗。将豚鼠分为亚单位疫苗一次免疫和二次免疫组、商品化灭活疫苗一次免疫组、空白对照组,疫苗免疫组豚鼠每只肌肉注射1ml,每组6只。制备气肿疽梭菌强毒菌液,计算其半数致死量。免疫21d进行攻毒保护试验,记录豚鼠免疫保护情况。通过建立间接ELISA方法,检测免疫豚鼠体内抗体水平。结果:1.PCR扩增出CctA全长基因约为970bp,与预期相符。经生物信息学分析表明,CctA蛋白是一种亲水性蛋白;结构域分析显示,该蛋白无跨膜区,有信号肽存在,有1个杀白细胞素成孔超家族蛋白;含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。2.PCR扩增出截短CctA基因大小为853bp,与预期相符。本试验成功构建了重组表达质粒,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析显示,得到大小为35KDa的包涵体蛋白,大小与预期相符。Western blot结果表明蛋白反应原性良好。3.制备的强毒菌液半数致死量为0.5×10⁶CFU。攻毒试验结果显示,气肿疽梭菌灭活苗免疫组对豚鼠的保护率为83%;亚单位疫苗一次及二次免疫对豚鼠的保护率均为66.7%。建立间接ELISA方法检测免后豚鼠体内抗体水平,分析表明,气肿疽梭菌灭活苗免疫组与亚单位疫苗免疫一次组相比有极显著差异（p<0.01）;同亚单位疫苗免疫二次组比较,显示差异显著（p<0.05）;亚单位疫苗免疫一次与免疫二次组无显著性差异（ns）;三组免疫组与对照组比较都显示出极显著性差异（p<0.001）。结论:本试验分析了CctA蛋白的特性,使截短CctA基因成功在大肠杆菌表达系统中表达,配制的亚单位疫苗免疫一次也可达到一定保护效果,而灭活苗刺激机体产生的保护性抗体明显高于亚单位疫苗。还需进一步优化实验方案,提高亚单位疫苗的免疫效果。