1、结直肠锯齿状病变RUNX3基因甲基化及蛋白表达的意义2、结直肠SSA/P和TSA的临床病理学及免疫组化研究

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[背景与目的]结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国常见的严重威胁人类健康恶性肿瘤。锯齿状病变具有恶变为CRC的潜能,近年来受到广泛关注。WHO(2010)消化系统肿瘤新分类把锯齿状病变定义为:一组以上皮呈锯齿状结构为特征的病变,包括:①增生性息肉(hyperplastic polyp,HP),根据黏液类型又分为微小泡型(microvesicula HP,MVHP)、杯状细胞型(goblet cell rich HP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP);②广基锯齿状息肉/腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P),③传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA);④锯齿状腺癌(serrated adenocarcinoma, SAC)。这些病变是1个连续的谱系,有明显的异质性,具有特殊的分子改变,呈现出1条与经典“腺瘤-癌”并存的新的致癌途径,即锯齿状通路。据最新报告,60%的CRC来自普通腺瘤,35%来自锯齿状通路,尤其是来自CpG岛甲基化表型(CpG island methlylator phenohype,CIMP)的锯齿状病变。锯齿状通路是一个多因素、多阶段、多基因改变的错综复杂的渐进性累积过程。在此演变过程中涉及多种癌和抑癌基因的表观遗传学改变,这些基因的异常改变导致了锯齿状病变特殊结构的生成和恶变生成CRC。DNA甲基化是表观遗传学的一种主要调控机制,异常甲基化将引起抑癌基因表达下调甚至沉默,进而导致肿瘤的发生。RUNX3(runt-related transcription factor3)是近年来新发现的一种抑癌基因,定位于人类染色体1号短臂1p36.1,RUNX3蛋白在TGF-β信号通路中发挥着重要的作用。RUNX3基因表达下调或沉默在人类多种肿瘤的发生发展过程中起着重要作用,而启动子区CpG岛高甲基化是RUNX3基因失活的主要发生机制。研究发现,RUNX3基因指导TGF-β信号转导过程而抑制细胞增生并促进凋亡,在CRC的发病机制中扮演重要角色,但RUNX3基因在锯齿状通路中作用尚不明确。目前国内、外有关RUNX3在锯齿状病变中作用的研究报告很少,更没有相关表观遗传学方面的研究。本研究通过Taqman探针为基础的实时荧光定量PCR(Real-timequantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法来分析锯齿状病变中RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化状态,并观察相应组织中RUNX3蛋白的表达情况,通过分析两者的关系,从而对RUNX3基因在锯齿状病变及锯齿状癌变通路中的作用进行初步探讨。[方法]收集2007-2012年间北京军区总医院病理诊断为锯齿状病变291例,进行回顾性阅片。所有切片按WHO(2010)消化系统肿瘤分类标准,由3名病理医师4~5轮阅片,从中筛选出77例锯齿状病变(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)作为实验组,并收集16例正常结直肠组织和14例CRC作为对照组。应用TaqMan探针为基础的RT-PCR技术检测29例HP、29例SSA/P、19例TSA、14例CRC和16例正常结直肠组织中RUNX3基因CpG岛甲基化状态。同时相应的组织均切片进行免疫组化染色,观察RUNX3蛋白的表达情况;并分析RUNX3基因甲基化与RUNX3蛋白的表达结果之间的关系。[结果]1.对RUNX3基因启动子CpG岛甲基化在正常组、HP组、SSA/P组、TSA组以及CRC组的状态进行统计学分析,结果显示:正常组织中未检测到RUNX3基因CpG岛甲基化;SSA/P、TSA、CRC三组甲基化率比正常和HP组明显增高,差异具有统计学意义,(P<0.05);但HP与正常组之间,SSA/P、TSA、CRC三组之间差异均不显著(P>0.05)。2.对RUNX3在正常组、HP组、SSA/P组、TSA组以及CRC组的免疫组织化学表达进行统计学分析,结果显示:RUNX3在SSA/P、TSA、CRC三组阳性率比正常组明显降低,且SSA/P、TSA、CRC三组分别与正常组之间有显著性差异(P<0.05);TSA、CRC两组分别与HP组之间有显著性差异(P<0.05);SSA/P与CRC之间有显著性差异(P<0.05);但HP分别与正常、SSA/P组,SSA/P与TSA组之间差异均不显著(P>0.05)。3. RUNX3甲基化与RUNX3蛋白表达相关性分析:SSA/P、TSA和CRC三组中RUNX3甲基化与RUNX3蛋白表达结果具有相关性(P<0.05),并且为负相关;而正常结直肠黏膜组织和HP中RUNX3甲基化与RUNX3蛋白表达结果相关性不显著(P>0.05)。[结论]1.免疫组化染色结果显示:RUNX3在正常肠组织、锯齿状病变、CRC中阳性表达率呈递减趋势,尤其是在SSA/P、TSA和CRC中阳性率明显降低;提示RUNX3蛋白表达减少或缺失可能是锯齿状病变发生和恶变通路中的必要条件。2.TaqMan探针RT-PCR结果显示:SSA/P、TSA、CRC三组甲基化率比正常和HP组明显增高,差异显著,(P<0.05);甲基化阳性率随病变严重程度呈增加趋势。RUNX3基因启动子CpG岛甲基化在锯齿状病变及CRC的发病机制中扮演重要角色。3. RUNX3基因启动子区域甲基化可能诱导RUNX3蛋白表达减少或缺失,提示其可促进锯齿状病变尤其是锯齿状腺瘤及癌变通路的发生,进而恶变为CRC。[背景与目的]近年来,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国发病率上升最快的恶性肿瘤之一,研究表明,CRC发病率持续增加的主要原因就是缺乏对锯齿状病变的正确认识。锯齿状病变的形态学、生物学行为及分子遗传学改变均不同于普通息肉和腺瘤。WHO(2010)消化系统肿瘤新分类中把锯齿状病变定义为:一组以上皮锯齿状结构为特征的病变,包括:①增生性息肉(hyperplastic polyp,HP),根据黏液类型又分为微小泡型(microvesicula HP,MVHP)、杯状细胞型(goblet cell richHP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP);②广基锯齿状息肉/腺瘤(sessileserrated adenoma/polyp, SSA/P);③传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA),并在结直肠癌亚型中分出锯齿状腺癌(serrated adeocarcinoma,SAC)。而且由于锯齿状病变命名分类的进展及对形态学特征解释的不同,即使是经验丰富的胃肠病理学家之间也有明显观察差异,诊断一致率低;尤其是SSA/P和TSA在形态学诊断上存在着较大的挑战性,近年来研究认为, TSA和SSA/P具有明确的恶变潜能,分别通过传统锯齿状通路和广基锯齿状通路发生癌变。SSA/P可进展为微卫星不稳定结直肠癌,TSA亦肯定可癌变,尽管癌变的分子类型不明确;但由于具有恶变潜能,应引起我们的注意和重视,但目前缺乏准确的诊断手段。因此本实验通过探讨41例SSA/P和23例TSA的临床病理学,与结直肠癌癌变通路相关的6种免疫组织化学标志物,旨在增强对SSA/P和TSA形态与功能的认识,提高诊断的正确率,降低CRC的发病率。[方法]收集北京军区总医院2007—2011间的结肠镜活检诊断为息肉和腺瘤的标本2418例,进行回顾性阅片。所有切片按WHO(2010)标准,由3名病理医师4~5轮阅片,筛选出锯齿状病变共291例。对上述291例锯齿状病变进行组织学诊断,从中筛选出41例SSA/P和23例TSA作为实验组。并收集34例HP、24例正常肠组织和28例CRC作为对照组。所选选标本均进行免疫组化MGMT、MLH1、β-catenin、p16、CDX2、RUNX3和Ki-67染色。[结果]SSA/P和TSA均好发于左半结肠。组织学显示,SSA/P锯齿状改变腺体紧靠黏膜肌层,基底隐窝呈倒“T”或“L”型分枝;TSA腺体可见明显的锯齿状结构、异位隐窝和细胞异型增生;其中纤维绒毛状TSA(FSA)兼具显著锯齿状结构、典型畸形隐窝和长纤维绒毛状突起特征,异型增生程度较高。免疫组化Ki-67阳性表达率和表达部位,在实验组与对照组正常和HP之间表达差异有统计学意义(P<0.05);β-catenin、p16和RUNX3表达阳性率,在实验组与对照组之间差异显著(P<0.05)。[结论]1. SSA/P锯齿状改变腺体紧靠黏膜肌层,基底隐窝呈倒“T”或“L”型分枝;TSA腺体可见明显的锯齿状结构、异位隐窝和细胞异型增生;FSA具有长纤维绒毛状典型特征,异型增生程度较高。2. β-catenin、p16和RUNX3免疫组化结果提示SSA/P和TSA较HP有明显差异,这三个基因可能在SSA/P和TSA的发生及恶变过程中起重要作用。3.免疫组化Ki-67结果提示在SSA/P和TSA具有较高的增殖活性,较HP具有更高的恶性潜能。同时Ki-67可以作为鉴别诊断HP、SSA/P和TSA的依据。
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