缢蛏是我国四大经济海洋养殖贝类之一,在其发育过程中需要经历重要的幼虫变态时期,该时期也是影响苗种产量和养殖效益的重要阶段。神经递质是生物生长发育过程中所需的化学物质之一,包括多巴胺,去甲肾上腺素等对贝类的生长和幼虫变态具有重要的调控作用。多巴胺β羟化酶是儿茶酚胺合成过程中重要的合成酶,催化多巴胺向去甲肾上腺素转化,其作用十分重要。目前针对贝类多巴胺β羟化酶作用的研究报道较少,在应用RNAi方法研究贝类幼虫的研究也几乎未见报道。本文鉴定了缢蛏两个多巴胺β羟化酶的序列并研究其表达特征以及在缢蛏生长和幼虫变态发育过程中的作用,以期为进一步阐明贝类幼虫变态的机制以及提高苗种繁育效率提供一定的参考。1.从缢蛏转录组数据库中比对获得两个多巴胺β羟化酶基因序列片段,并进行验证和cDNA全长的克隆,分别命名为ScDβH和ScDβH-α。ScDβH基因的cDNA序列全长为1959 bp,包含15 bp的5’末端非翻译区(UTR),222 bp 3’-UTR,以及1722 bp开放阅读框(ORF),编码573个氨基酸残基。该基因的预测分子量为64.50 k Da,理论等电点为5.40。ScDβH-α基因cDNA序列全长为2079bp,包含67 bp的5’末端非翻译区(UTR),272 bp的3’-UTR以及1740 bp的ORF,编码579个氨基酸残基。该基因的预测分子量为64.97 k Da,理论等电点为5.35。系统发育树的结果表明,DβH基因分为两大支,缢蛏DβH基因与无脊椎动物DβH基因的其中一支聚在一起,且ScDβH和ScDβH-α属于同一亚型的DβH基因。2.利用实时荧光定量PCR技术检测ScDβH和ScDβH-α基因在缢蛏7个成体组织(包括肝胰腺、鳃、足、性腺、外套膜、血淋巴、水管)和7个幼虫发育时期(胚胎期,担轮期,D型期,壳顶期,匍匐期,单水管期,稚贝期)的表达水平。结果表明ScDβH和ScDβH-α在各个组织中广泛表达。ScDβH基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在血淋巴和鳃组织的相对表达量显著高于其他组织。ScDβH-α基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在水管组织中的相对表达量最低,而在其他组织中基因的相对表达量均差异不显著。ScDβH和ScDβH-α基因在前期幼虫发育阶段的表达量均不高,两个基因分别从匍匐期和壳顶期开始,基因的表达量逐渐上升,直至稚贝,基因的表达量达到最高。3.筛选了多巴胺β羟化酶适合的抑制剂及其浓度。对三个多巴胺β羟化酶抑制剂,包括Nepicastat HCl(Nep),Fusaric acid(Fus),Disulfiram(Dis)进行了筛选实验,结果表明Nep为最适合的抑制剂,且其最适浓度为1μg/ml(即1 mg/L)。应用Nep抑制剂,对变态发育时期的缢蛏幼虫进行了浸泡实验,结果表明,抑制剂能够有效地抑制缢蛏幼虫的变态发育,并对其存活率有一定的影响。在缢蛏稚贝的生长实验中,发现在Nep抑制剂组,稚贝的体重和壳长被显著抑制。4.利用RNAi技术,检测DβH基因在缢蛏幼贝生长和幼虫变态发育过程中的作用。首先设计并筛选出合适的siRNA链,以及合适的siRNA浓度(1.1μg/ml)。其次,利用浸泡技术对缢蛏幼虫进行了RNAi实验。结果显示,siRNA组的变态率被显著抑制,高浓度siRNA组的存活率也显著降低。利用RNAi注射技术对缢蛏幼贝进行了RNA干扰实验,siRNA组,幼贝的壳长和体重均被显著抑制。进一步检测了DβH所在通路下游的相关生长因子,表明当DβH基因部分沉默后,相关生长因子基因的表达被不同程度地抑制。研究结果揭示了DβH基因对缢蛏幼贝生长和幼虫变态发育过程中具有重要影响。