目的构建miRNA-451真核表达重组质粒及其对照重组质粒,转染小鼠肾小球系膜细胞,研究miRNA-451对肾小球系膜细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的影响。方法依据miRBase数据库中mmu-miR-451序列,添加酶切位点及polyT转录终止序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1质粒中,经酶切鉴定及测序验证后,构建成为miRNA-451真核表达载体(pGenesil-1-miRNA-451质粒)。同时同法设计一对随机对照单链寡核苷酸片断构建成为阴性对照重组质粒(pGenesil-1-control)。将pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control质粒用lipofectamine 2000分别转染小鼠肾小球系膜细胞,经G418筛选,建立稳定表达pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线; RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测转染前后iNOS基因蛋白质表达水平,运用生物学软件分析图像结果。结果经酶切鉴定及测序证实pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control重组质粒构建成功。与未处理的小鼠肾小球系膜细胞和稳定表达pGenesil-1-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-1-miRNA-451的小鼠肾小球系膜细胞中,细胞增殖受到抑制,iNOS基因的蛋白质表达明显受到抑制,而iNOS基因的mRNA水平无明显变化。结论miRNA-451在翻译水平抑制了iNOS基因的表达,并对小鼠肾小球系膜细胞生长具有显著的抑制作用。