胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是恶性程度最高的原发性中枢神经系统肿瘤,预后极差。免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade,ICB）疗法是跨时代的肿瘤治疗手段,在许多癌症治疗中显示出巨大的潜力但在GBM的治疗中,由于程序性细胞死亡配体1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）在GBM细胞中高表达,同时主要组织相容性复合物-I（Major histocompatibility complex-I,MHC-Ⅰ）被下调,导致GBM具有免疫抑制微环境和低免疫原性,ICB疗法效果不佳。干扰素-γ（Interferon gamma,IFN-γ）能够上调细胞MHC-Ⅰ的表达,与ICB治疗剂anti-PD-L1 m Ab联合给药能够显著增强ICB疗法对于GBM的疗效。然而,anti-PD-L1 m Ab和IFN-γ均需透过血脑屏障到达GBM部位才能发挥治疗效果,因此,需要一种药物递送平台将二者共同靶向递送。外泌体（Exosome,Exo）作为生物来源的药物递送载体具有良好的生物安全性,能够递送多种生物大分子跨越生理屏障,并免受降解。但基于细胞来源的Exo产量极低,为此我们开发了纳秒脉冲电穿孔（Nanosecond pulse electroporation,ns EP）系统,能够实现在细胞转染的同时,刺激Exo大量释放。本研究中使用过表达CD64的工程化Exo（CD64-Exo）,表面连接anti-PD-L1 m Ab和anti-CD71 m Ab,同时内部加载IFN-γ的m RNA。制备的“im Exo”同时具备GBM靶向性和ICB治疗活性,并且能够逆转GBM免疫抑制环境,增强ICB疗法对于GBM的治疗效果。本论文的研究内容主要包括以下几个部分:1、基于ns EP系统促进Exo释放的条件优化及机制的研究本研究将ns EP与标准毫秒脉冲（Millisecond pulse electroporation,ms EP）耦合,结合微流体电穿孔技术开发了ns EP系统。为提高细胞的Exo产量,同时不影响细胞活力,我们优化了ns EP的振幅,脉冲宽度以及频率。对于MEF细胞经优化后的ns EP条件是180 V、600 ns和100 k Hz;对于HEK293T细胞优化后的ns EP条件是150 V、600 ns和100 k Hz。实验结果证实,ns EP系统能够大批量处理Exo供体细胞（5 min内处理3.0×10~7个细胞）,并实现大规模生产工程化Exo。相较于标准ms EP,经条件优化后的ns EP系统能够使MEF细胞和HEK293T细胞Exo产量提高5倍以上。我们通过蛋白质组学分析研究了ns EP系统促进细胞释放Exo的机制。实验结果显示,在基于ns EP系统的Exo释放过程中,混合谱系激酶结构域如假激酶起关键调控作用。2、im Exo的制备及表征为制备CD64-Exo,我们首先成功构建了稳定过表达CD64的MEF细胞系。为了在CD64-Exo中特异性加载IFN-γ的m RNA,我们将RNA结合多肽N pep克隆到CD64的C端,同时在IFN-γ的m RNA的3’端添加box B序列,其能够自组装成颈环结构而被N pep结合。通过引入N pep/box B,CD64-Exo中IFN-γ的m RNA含量增加超过2倍,说明CD64-Exo能够实现目标m RNA的特异性加载。CD64是一种Fcγ受体,可以与免疫球蛋白G的Fc段结合。我们将anti-CD71 m Ab和anti-PD-L1 m Ab通过CD64连接在CD64-Exo表面并优化了CD64-Exo（总蛋白）/anti-CD71 m Ab/anti-PD-L1 m Ab的比例,当CD64-Exo/anti-CD71m Ab/anti-PD-L1 m Ab=1/1/3（w/w/w）时,实现了两种抗体的高效加载,成功制备im Exo。3、im Exo体外抗肿瘤评价能够被GBM细胞摄取是im Exo发挥治疗效果的重要条件,因此,我们首先评价了im Exo的细胞摄取。结果显示,相比于未修饰Exo,im Exo在GBM细胞中的摄取增加2倍以上,摄取途径分析显示,im Exo可通过CD71介导的网格蛋白依赖的内吞途径进入GBM细胞。随后我们评价了im Exo的体外抗肿瘤活性,实验结果显示,im Exo能够显著上调GBM细胞培养液中IFN-γ的浓度,并在体外上调GBM细胞MHC-Ⅰ的表达。通过对im Exo的生物安全性进行评价,证实im Exo不会造成溶血。健康小鼠在给药2倍治疗剂量下,没有发现明显的肝肾毒性,证实im Exo适合进行后续体内研究。4、im Exo体内抗肿瘤评价本研究分别在两种GBM原位模型中评价了im Exo的体内抗肿瘤效果。体内分布实验证实,im Exo在体内能够有效的靶向GBM。在GL261模型中相较于对照组,im Exo抑制了70.5%的肿瘤生长,与游离抗体组相比抑制了52.2%的肿瘤生长。接受im Exo治疗的小鼠半数生存时间为53.5天,相比于对照组28.5天生存期显著延长。肿瘤组织免疫分析显示,im Exo治疗能够显著增加肿瘤组织中表达IFN-γ的细胞分群比例,从而促进了CD8+T细胞的肿瘤浸润。GL261模型肿瘤具有中等的免疫细胞浸润和适度的免疫抑制微环境,对于ICB疗法有一定疗效。我们在具有高度免疫抑制微环境的SB28模型中进一步评价了im Exo的抗肿瘤效果,该模型被认为与人类GBM免疫环境高度类似。实验结果显示,im Exo相比于对照组抑制了79.5%的肿瘤生长,小鼠的半数生存时间得到显著的延长（im Exo组为52天,对照组为27天）。肿瘤组织免疫分析显示,im Exo治疗恢复了SB28细胞的MHC-Ⅰ表达,同时,增加了肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润。在SB28模型的肿瘤组织中,肿瘤相关巨噬细胞大量浸润,我们额外评价了治疗后SB28肿瘤组织中巨噬细胞的表型。结果显示,im Exo治疗后肿瘤组织中促炎性M1极化巨噬细胞的分群显著增加,说明im Exo能够对GBM免疫抑制微环境进行重编程,从而增强GBM对ICB治疗的反应。综上所述,本研究开发的ns EP系统能够实现工程化Exo的规模化生产;设计的CD64-Exo可作为一种通用的生物大分子递送平台,引入N pep/box B能够实现m RNA的特异性加载;制备的im Exo能够靶向GBM并具有ICB治疗效果,同时im Exo能够调节GBM微环境,增强ICB疗法的抗肿瘤作用,具有广阔的应用前景。