背景与目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国恶性肿瘤患者死亡率中排名第二。奥沙利铂(oxliaplatin,L-OHP)是一类新的铂类化疗药,通过形成烷化结构使DNA发生链内与链间交联,阻断细胞DNA复制和转录,从而产生细胞毒作用和抗肿瘤活性。近年临床文献表明,以L-OHP为主的化疗方案对HCC患者有较好的疗效,安全性和耐受性高,不良反应轻。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由肿瘤细胞周围的活性因子(如细胞因子)、化学物质(如葡萄糖、氧分子、氢离子)、非恶性细胞(如上皮细胞、间质细胞、内皮细胞、成纤维细胞)、结构成分(如细胞外基质)等构成的局部内环境。越来越多的研究发现肿瘤微环境涉及肿瘤发生、转移及耐药机制。微环境化学因素对L-OHP的HCC细胞生物效应究竟有无影响及其机制如何,目前尚缺乏报道。我们针对这一问题开展研究,旨在为改良HCC局部化疗方法提供相应的实验基础与理论依据。实验方法1.选择SMMC-7721 HCC细胞株,体外培养与分组。将葡萄糖(glucose)、氧(O2)、乳酸(lactic acid)、碳酸氢盐(bicarbonate)各浓度作为肿瘤微环境变量因素对培养细胞进行不同组合的处理,其中高糖(high glucose,含4.5 g/L葡萄糖)培养8组:高糖常氧(normoxia,20%O2培养)、高糖缺氧(hypoxia,1%O2培养)、高糖常氧乳酸酸中毒(培养基加纯乳酸至终浓度20 mmol/L,p H 6.7)、高糖缺氧乳酸酸中毒、高糖常氧代谢性碱中毒(培养基加5%碳酸氢钠溶液,p H 8.0)、高糖缺氧代谢性碱中毒、高糖常氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒(培养基p H调至7.0)、高糖缺氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒;低糖(low glucose,含1.0 g/L葡萄糖)培养8组:低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧代谢性碱中毒、低糖缺氧代谢性碱中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒。光镜下观察各组细胞形态与生长状态。采用CCK-8法检测各组细胞0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式细胞术检测细胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡数;采用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率;采用Transwell小室、划痕实验检测细胞迁移率。通过上述研究观察微环境中不同化学因素对HCC细胞的生物效应。2.选择对HCC细胞影响显著的微环境化学因素作为培养条件,并选取0.625μg/ml、1.250μg/ml、2.500μg/ml、5.000μg/ml、10.000μg/ml、20.000μg/ml、40.000μg/ml、80.000μg/ml和160.000μg/ml 9个不同L-OHP终浓度处理SMMC-7721 HCC细胞24 h、48 h、72 h,采用CCK-8法检测OD值,观察该化学性微环境中L-OHP半数致死浓度,确定后续实验采用的L-OHP浓度。3.应用选定的L-OHP浓度,在观察到的微环境中不同化学因素对HCC细胞生物效应影响的基础上分组处理细胞。光镜下观察各组细胞形态与生长状态。采用CCK-8法检测各组细胞处理后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式细胞术检测各L-OHP处理组细胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法检测各L-OHP处理组凋亡细胞数;采用Annexin V-FITC/PI染色法检测各L-OHP处理组细胞凋亡率;采用Transwell小室实验检测各L-OHP处理组细胞迁移率。通过这些实验观察微环境不同化学因素对L-OHP的HCC细胞生物效应的影响。4.选择对HCC细胞影响显著的微环境因素,并采用选定浓度的L-OHP分组分别处理SMMC-7721株与Bel-7404株HCC细胞,采用Western blot法检测胞内SET7/9、p53、p65表达,初步探讨微环境不同化学因素影响L-OHP的HCC细胞生物效应的机制。实验结果1.光镜下可见,各高糖处理组细胞皆呈三角形贴壁生长;各低糖处理组中,低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒组细胞变长,贴壁生长,而低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧代谢性碱中毒、低糖缺氧代谢性碱中毒时细胞于72 h漂浮死亡。2.CCK-8法检测结果显示培养的HCC细胞受低糖与缺氧组合影响较为显著,故选择低糖缺氧(Control)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis)、低糖缺氧代谢性碱中毒(Metabolic alkalosis)、低糖缺氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis)4组进行后续实验。流式细胞术检测、Hoechst 33342染色法检测、Annexin V-FITC/PI染色法检测、Transwell小室与划痕实验结果分别显示:与低糖缺氧组(Control)比较,Lactic acidosis组、Lactic acidosis+Metabolic alkalosis组G1期细胞百分含量增加、凋亡数与凋亡率降低或明显降低、细胞迁移率明显增加,Metabolic alkalosis组细胞凋亡数与凋亡率明显增加或增加、细胞迁移率降低。3.CCK-8法实验结果显示,在低糖与缺氧组合培养条件下,L-OHP处理HCC细胞呈现剂量与时间依赖性增殖抑制效应,其中10μg/ml L-OHP作用48 h HCC细胞增殖抑制率为50%。选取该L-OHP浓度分别处理低糖缺氧(L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis+L-OHP)、低糖缺氧代谢性碱中毒(Metabolic alkalosis+L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒代谢性碱中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP)4组HCC细胞。细胞培养48 h后,光镜下可见未加用L-OHP的低糖缺氧组(Control)细胞皱缩变圆,Lactic acidosis+L-OHP组和Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP组细胞变长贴壁生长,L-OHP组与Metabolic alkalosis+L-OHP组细胞大量死亡、漂浮。CCK-8法检测结果还显示与未加用L-OHP的低糖缺氧组(Control)比较,加用L-OHP各组24 h、48 h、72 h OD值均显著下降;与L-OHP组比较,加用L-OHP的其它3组OD值呈不同程度变化:Metabolic alkalosis+L-OHP组OD值下降,Lactic acidosis+L-OHP组与Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP组OD值增加、尤其前者。4.流式细胞术检测显示,与未加用L-OHP的低糖缺氧组(Control)比较,L-OHP组与Metabolic alkalosis+L-OHP组S期细胞百分含量增加。Hoechst 33342染色法检测、Annexin V-FITC/PI染色法检测和Transwell小室实验检测结果显示,与未加用L-OHP的低糖缺氧组(Control)比较,L-OHP组细胞凋亡数与凋亡率增加,细胞迁移率降低;与L-OHP组比较,Lactic acidosis+L-OHP组细胞凋亡率降低、细胞迁移率增加,而Metabolic alkalosis+L-OHP组细胞凋亡数与凋亡率增加、细胞迁移率明显降低。5.Western blot检测结果显示,在低糖、缺氧条件下,不同微环境化学因素组合处理SMMC-7721、Bel-7404两株细胞,与低糖缺氧组(Control)比较,Lactic acidosis组细胞内SET7/9表达明显增高,Metabolic alkalosis组SET7/9表达则明显降低;p65表达未见明显改变。相同条件联合L-OHP分组处理两株细胞时,与未加用L-OHP的低糖缺氧组(Control)比较,L-OHP组SET7/9表达明显降低(SMMC-7721细胞)或降低(Bel-7404细胞);与L-OHP组比较,两株细胞Lactic acidosis+L-OHP组SET7/9表达皆明显增加,Lactic acidosis+Metabolic alkalosis组都有所增高,而Metabolic alkalosis+L-OHP组SET7/9表达都降低;p65表达也未见明显变化。上述两种情况下两株HCC细胞皆未检测到p53表达。结论1、本研究所观察的微环境化学因素中,低糖与缺氧组合对SMMC-7721细胞增殖抑制效应最明显。此时,乳酸酸中毒促进HCC细胞增殖、迁移而抑制凋亡,代谢性碱中毒则呈现相反作用。2、在本研究低糖、缺氧条件下,一定浓度L-OHP能抑制HCC细胞增殖、促进细胞凋亡与降低细胞迁移率,这种效应被微环境中乳酸酸中毒削弱,但代谢性碱中毒有协同作用。3、在本研究低糖、缺氧条件下,一定浓度L-OHP在抑制HCC细胞增殖与迁移的同时会使胞内SET7/9表达下调,这种效应受微环境中代谢性碱中毒加强,却受乳酸酸中毒明显逆转。提示蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9介导的胞内信号通路与L-OHP抗HCC细胞效应机制相关,值得进一步研究证实。