论文部分内容阅读
目的:胰腺癌（pancreatic cancer）是一种死亡率极高的恶性消化道肿瘤。因患者被诊断时往往已经处于晚期,甚至大部分患者已发生邻近器官的浸润或是远处转移,从而丧失了最佳治疗时机而致其5年生存期低于6%。因此胰腺癌的早期诊断对其采取相应的治疗方案有着决定性的意义。肿瘤细胞的生成源于正常细胞的不规则生长,其与肿瘤基因的激活和抑瘤基因的失活有着密切的关系。但是鉴于影响胰腺癌的因素众多,涉及的一系列的肿瘤基因、抑瘤基因和信号通路使得胰腺癌的发生发展机制仍不甚明了。在以往诸多报道中TMEM（transmembrane proteins）家族成员与各种肿瘤的发生有着密切的联系。而最近兴起的TMEM家族中TMEM45B与肿瘤的相关报道至今仍未见报道。因此本研究拟通过对中TMEM45B基因与胰腺癌的增殖、侵袭、转移及凋亡予以探讨,旨在了解TMEM45B在胰腺癌进程中发挥的作用及机制,为胰腺癌的相关诊疗工作提供新思路。方法:在前期研究工作中,我们发现TMEM45B与肿瘤的发生密切相关。因此本研究收集了20052013年45例经病理学鉴定的外科手术切离的胰腺癌组织及癌旁组织标本,并使用qRT-PCR和免疫组化对45例组织中TMEM45B基因的表达水平和蛋白表达水平进行鉴定和检测。同时本研究还以胰腺癌5种细胞系（BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1、和PANC-1）和一种正常胰腺细胞系HPDE6-C7为对象使用qRT-PCR和WB进行mRNA和蛋白水平的检测,并随后以高表达TMEM45B的两种细胞系（SW1990和PANC-1）进行后续功能研究实验的实施对象。为了进一步研究TMEM45B在肿瘤进程中的功能,本研究使用基因富集分析技术（Gene set enrichment analysis,GSEA）对TMEM45Bhigh和TMEM45Blow细胞系与细胞周期相关基因和肿瘤转移相关基因的相关性进行分析。为了进一步证明TMEM45B对细胞周期和肿瘤转移的影响,本研究选用SW1990和PANC-1两种细胞系,并设计pLKO.1-C1/sh-TMEM45B进行细胞转染,并对细胞周期相关蛋白中的3个核心蛋白（PCNA、CDK1和CDC25A）以及转移相关蛋白中的3个核心蛋白（RAB1A、MAP4K3和NME2）行WB检测,并对其基因表达水平行qRT-PCR检测。为了证明TMEM45B基因对增殖的影响,本研究分别通过体内和体外实验进行评估:1)对SW1990和PANC-1两种细胞系转染sh-TMEM45B,在随后的24h、48h和72h通过对细胞相对数量的检测进行评估;2)本研究为了较为明显的观察肿瘤生长状况,选用了增殖速度较快的细胞系SW1990同时并构建了相应的稳定转染细胞系,并以此细胞系接种裸鼠,12d后观察并测量肿瘤组织体积大小及重量。为验证TMEM45B对细胞周期的影响,本研究分别转染sh-TMEM45B入SW1990和PANC-1细胞系,并通过流式细胞术分析TMEM45B对细胞周期及细胞凋亡的影响。同时我们还使用transwell对侵袭和转移进行检测。结果:本研究通过对45例胰腺癌的临床组织标本行免疫组化和WB检测,结果也验证了TMEM45B在胰腺癌组织中其mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁组织（P<0.01）。与此同时我们还对5种细胞系（BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1和PANC-1）和一种正常胰腺细胞系HPDE6-C7为对象进行mRNA和蛋白水平的检测,结果显示SW1990和PANC-1两种细胞系TMEM45B表达水平较高,遂入选并作为后期的实验细胞。为进一步研究TMEM45B在肿瘤中的作用,本研究成功设计了pLKO.1-C1/sh-TMEM45B,并使用GSEA手段分析TMEM45B与肿瘤细胞周期及转移直接相关。随后,我们通过sh-TMEM45B干扰TMEM45B表达,并对细胞周期相关的核心蛋白及转移相关核心蛋白进行检测,结果显示干扰后核心蛋白相对含量均较干扰前显著下降（P<0.01）;在TMEM45B对细胞增殖的研究数据显示,两种细胞系中sh-TMEM45B干扰组体外细胞增殖水平在24h、48h以及72h均显著低于同一时间点的未处理组（P<0.01）,体内实验数据同样显示,干扰组裸鼠肿瘤组织体积及重量显著小于未处理组（P<0.01）;而细胞周期实验发现两种细胞系的sh-TMEM45B干扰组其G1期细胞比例较未处理组显著升高（P<0.01）,而S期比例显著下降（P<0.01）,对G2期无明显影响,而过表达TMEM45B组,其G1、S1和G2较未处理组差异无统计学意义（P>0.05）;sh-TMEM45B干扰能够显著的增加细胞的凋亡,而过表达使得细胞凋亡减少,实验数据显示其对早期凋亡的影响尤为显著（P<0.01）,并且WB初步证明其凋亡与Bax和Caspase3蛋白高表达相关。同时对TMEM45B在侵袭、转移中的作用研究发现,其表达降低侵袭性也随之降低,表达升高其侵袭性也随之升高。反之,本研究选择TMEM45B表达水平较低的CFPAC-1细胞系,并使用慢病毒使CFPAC-1高表达TMEM45B,随之对细胞系增殖能力、侵袭能力、抗凋亡能力及细胞周期进行检测。结果显示,过表达TMEM45B的CFPAC-1细胞其增殖能力在24h、48h、72h时均显著高于对照组;同时过表达TMEM45B组其凋亡比例显著低于对照组;transwell实验亦证明了过表达TMEM45B使得胰腺癌细胞侵袭力显著提升;同样TMEM45B也影响CFPAC-1细胞周期,即G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高。结论:TMEM45B作为一种膜蛋白分子,其通过影响细胞周期及转移相关蛋白与胰腺癌的增殖、侵袭、转移和凋亡密切相关。提示其能够作为一种新型的靶标,为胰腺癌的临床诊疗提供新的思路。