肝脏缺血再灌注（Ischemia and reperfusion,I/R）损伤的核心是过度的炎症反应。该损伤分为两个时相:I相主要为激活的枯否细胞（Kupffer cell, KC）连同其分泌的细胞因子（如TNF-α、IL-1β等）引起的损伤;II相则是在KC,趋化性细胞因子、粘附分子等共同作用下,导致中性粒细胞（Polymorph nuclear leukocyte,PMN）趋化、黏附、聚集、活化所介导的损伤。后者是肝脏I/R损伤的关键,其结果是肝细胞的坏死和凋亡,最终引起肝功能衰竭、甚至全身多脏器功能障碍综合征。Toll样受体4 （Toll-like receptor 4,TLR4）是新近发现的启动机体急性炎症反应的受体,在天然免疫中起重要作用。通过该受体可诱导促炎细胞因子的产生,启动机体的炎症防御机制。已证明TLR4参与肝脏I/R损伤。TLR4分布于肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelia cells,LSEC）、KC及PMN,虽然肝细胞也表达TLR4,但一般认为该细胞的TLR4不参与肝脏I/R损伤。有人证实在同一脏器组织中,不同细胞表达的TLR4在急性炎症过程中的作用不同。用氯化钆阻断肝脏KC细胞功能后,虽然可减轻肝I/R损伤,但是与假手术对照比较,仍有明显损伤,提示除KC外,其它细胞如PMN及LSEC表达的TLR4也可能参与启动肝脏I/R的炎症过程。因此,本研究目的在于观察肝脏内不同细胞表面TLR4在肝I/R损伤中的作用,阐明其通过招募、活化PMN而参与肝脏I/R II期损伤的机制。一、骨髓移植小鼠模型的建立及鉴定将两种纯系雄鼠C3H/HeJ (TLR4^Mut/Mut)及C3H/HeN (TLR4^+/+)的骨髓分别移植于同系雌鼠或交叉移植于相应品系的雌鼠,骨髓移植10周后,通过比较接受及未接受骨髓移植小鼠的死亡率,用FISH和PCR检测受者的Y染色体及SRY基因,证实骨髓移植成功。故本研究获取了以下2种纯合体小鼠和2种嵌合体小鼠,为后续实验研究不同细胞表面TLR4在肝脏I/R损伤中的作用奠定基础。小鼠名称供体基因型受体基因型表型WT/WT TLR4^+/+ TLR4^+/+源细胞TLR4 ^+/+/非髓源细胞TLR4 ^+/+ Mut/Mut TLR4^Mut/Mut TLR4^Mut/Mut源细胞TLR4^Mut/Mut/非髓源细胞TLR4^Mut/Mut WT/Mut TLR4^+/+ TLR4^Mut/Mut源细胞TLR4 ^+/+/非髓源细胞TLR4^Mut/Mut Mut/WT TLR4Mut/Mut TLR4^+/+源细胞TLR4^Mut/Mut/非髓源细胞TLR4 ^+/+二、比较髓源及非髓源细胞TLR4在肝脏I/RⅡ期损伤中的作用用上述4种类型的小鼠建立肝脏部分缺血再灌注损伤动物模型。各组动物模型中门静脉血清无内毒素污染,外周血谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）水平明显上升,HE及电镜显示肝细胞受损,炎性细胞浸润,且均在肝脏恢复灌注6-12小时最为显著。四组比较,在恢复灌注6小时及12小时,Mut/Mut小鼠肝损伤最轻,而髓源细胞TLR4突变者组（Mut/WT）小鼠肝组织损伤较髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）轻（P <0.05）,提示髓源及非髓源细胞TLR4均参与了肝脏I/RⅡ期损伤,但髓源细胞TLR4的作用更大。三、髓源及非髓源细胞TLR4参与肝脏I/RⅡ期损伤的机制研究为进一步探讨髓源及非髓源细胞TLR4参与肝脏I/RⅡ期损伤的机制,我们主要观察上述4种动物肝脏缺血再灌注Ⅱ期损伤时中性粒细胞的变化,证实: 1.髓源及非髓源细胞细胞TLR4在肝脏I/R时对PMN聚集的影响:用特异性酯酶D对中性粒细胞进行特异性染色和记数,并测定其产生的髓过氧化物酶。结果证实在恢复灌注后3小时,各组肝组织间隙内PMN水平明显上升,6至12小时仍维持在较高水平。四组比较,恢复灌注6小时,WT/WT组PMN水平最高,Mut/Mut最低,髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）高于髓源细胞TLR4突变型（Mut/WT）（p<0.05）;恢复灌注12小时,WT/WT组与髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）的PMN聚集均高于髓源细胞TLR4突变型（Mut/WT）组及^Mut/Mut组（p<0.05）。提示在肝脏I/RⅡ期损伤中,PMN的聚集程度与TLR4相关,且髓源细胞表面TLR4的作用较大。2.髓源及非髓源细胞TLR4在肝脏I/R时对参与PMN募集相关因素的影响:（1）促炎细胞因子:用ELISA检测证实在恢复灌注后3小时各组小鼠产生TNF-α和IL-1β达高峰。四组组间比较,WT/WT组的TNF-α,IL-1β水平最高,其次为髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）,均高于髓源细胞TLR4突变型组（Mut/WT）,而^Mut/Mut组水平最低,组间差异有显著性。（2）趋化性细胞因子:用ELISA检测发现各组内MIP-2水平在再灌注3小时及6小时最高,四组组间差异与促炎细胞因子相似。（3）黏附分子:用用Western证实Mac-1/CD11b在I/R损伤晚期明显升高,其组间差异与上相同。ICAM-1的表达亦在I/R损伤晚期明显升高,与Mac-1/CD11b不同的是,虽然WT/WT组ICAM-1表达最强,^Mut/Mut组最弱,但髓源细胞TLR4突变型（Mut/WT）组表达强于髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）。ICAM-1免疫组化结果与Western结果一致,且在再灌注12小时,WT/WT组及髓源细胞TLR4突变型组（Mut/WT）肝细胞ICAM-1染色呈强阳性表达,而髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）及^Mut/Mut小鼠肝细胞ICAM-1染色仅呈弱阳性。上述结果提示TLR4影响肝脏缺血再灌注损伤中促炎细胞因子、趋化性细胞因子和粘附分子的表达,进而影响PMN在肝脏I/RⅡ期损伤中的效应。髓源细胞TLR4主要促进促炎细胞因子、趋化性细胞因子及Mac-1的表达,而非髓源细胞TLR4对ICAM-1表达的影响则更大。四、PMN/TLR4体外对肝脏I/R局部介质的应答（1）TLR4对肝脏I/R的肝匀浆液趋化PMN的影响:我们在体外用Transwell观察缺血1小时再灌注3小时肝组织匀浆液对TLR4^+/+ PMN及TLR4^Mut/MutPMN迁移及穿越内皮能力的影响,结果证实WT/WT匀浆液组趋化作用最强,髓源细胞TLR4野生型组（WT/Mut）强于髓源细胞TLR4突变型组（Mut/WT）,^Mut/Mut组作用最弱;此外,每组匀浆液对TLR4^+/+PMN的趋化作用均强于趋化TLR4^Mut/Mut PMN。提示髓源细胞TLR4不仅可通过影响趋化物质的表达量来影响PMN的迁移及内皮穿越功能,而且PMN表面功能性TLR4尚可增强PMN对趋化物质的敏感性。（2）TLR4对MIP-2介导PMN穿越内皮能力的影响:用MIP-2中和抗体可显著抑制肝脏I/R的肝匀浆液诱导TLR4^+/+PMN的内皮穿越能力,对TLR4^Mut/Mut PMN的影响力较弱,提示PMN的TLR4能增强其对MIP-2趋化能力的敏感性。（3）TLR4对CD11b介导PMN粘附及内皮穿越能力的影响:用黏附实验及Transwell实验证实CD11b中和抗体可明显抑制TLR4^+/+PMN的粘附能力及肝脏I/R的肝匀浆液诱导TLR4^+/+PMN的定向运动能力及,且此影响均强于TLR4^Mut/MutPMN,提示PMN的TLR4能增强其对CD11b的反应性。（4）TLR4对TNF-α介导PMN聚集的影响:用TNF-α抗体中和各组肝组织匀浆液的TNF,结果对TLR4^+/+PMN及TLR4^Mut/Mut PMN的趋化能力无影响;但TNF-α却能激活PMN,增强TLR4^+/+PMN及TLR4^Mut/Mut PMN穿越内皮的能力,但两者无显著性差异。提示TNF-α可促进PMN内皮穿越能力,但该作用与TLR4无关。用TNF-α激活假手术TLR4^+/+及TLR4^Mut/Mut鼠的PMN,RT-PCR检测证实TNF-α可促进PMN CD11bmRNA及MIP-2 mRNA转录,但该作用与PMN的TLR4无关。（5）用RT-PCR证实缺血再灌注刺激可增强TLR4^+/+及TLR4^Mut/Mut PMN转录CD11b及MIP-2 mRNA ,但TLR4^+/+PMN转录这两种因子mRNA水平均高于TLR4^Mut/Mut PMN,提示TLR4可上调缺血再灌注损伤诱导PMN对这两因子的表达。本研究通过体内实验证实TLR4,特别是髓源细胞TLR4在肝脏I/R时,通过促进促炎细胞因子、趋化性细胞因子及粘附分子的表达来导致PMN在肝脏的聚集和活化,进而介导I/RⅡ期损伤;体外实验进一步证实TLR4不仅可上调缺血再灌注诱导CD11b和MIP-2的表达量来影响PMN的活化、粘附及穿越内皮等功能,同时PMN表面有功能的TLR4可增强其对MIP-2的敏感性。