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类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei）简称类鼻疽菌,是一种革兰阴性兼性胞内病原体,可以引起称为类鼻疽的人兽共患病。作为一种热带医学疾病,类鼻疽主要流行于东南亚、澳大利亚北部等区域,我国主要分布于广东、海南、广西、香港以及台湾等地区。类鼻疽临床表现复杂多样,被称为“似百样病”,典型症状为难治性肺炎和多发性脓肿,可迅速发展为败血症,死亡率高达50%,目前尚无特效药物,复发率高达30%,由于其易获取、诊断难、致病性强且目前尚无有效疫苗,美国疾病控制与预防中心将其列为Ⅰ类病原体加以防范。随着“一带一路”以及中国（海南）自由贸易试验区等国家重大战略项目的实施,我国面临类鼻疽流行的风险日益严峻,加强类鼻疽的研究,寻找有效的防治策略迫在眉睫。微生物全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）为提高病原体的诊断和防控能力带来了希望,它在我们应对微生物进化、爆发和传播等事件方面产生的巨大价值已经得到证实,包括对金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、SARS-Co V-2的防控和结核分枝杆菌的耐药性监测等。类鼻疽菌由于胞内寄生以及耐药性强的特性,其临床治疗难以根除且容易复发,具体机制目前仍不清楚。本研究首先使用第三代测序技术对我国临床分离的类鼻疽菌BPC006进行了全基因组精细测序,通过生物信息学方法预测分析得到其基因组特征,包括基因组成、基因功能、表观遗传修饰、CRISPR序列等,为进一步研究类鼻疽菌致病机制、耐药性及传播等方面提供了有力的分子基础。同时,对从一例时隔五年复发的类鼻疽病人身上分离出的两株类鼻疽菌临床分离株进行第三代全基因组测序,通过多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）、同源比对系统进化树、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）以及插入缺失（insertion-deletion,In Del）分析,排除了由不同菌株导致的再感染,并鉴定了复发株中主要的基因组变化。此外,本研究通过双向电泳-质谱技术分析了以上两株不同临床分离株在蛋白水平的表达变化,并通过胞内生存实验分析了两株细菌的胞内存活增殖能力,为进一步研究类鼻疽菌的持续性感染机制及防治提供了有价值的参考。最后,在全基因组测序的基础上,本研究以类鼻疽菌Ⅵ型分泌系统相关基因簇BPSS0109基因为检测靶基因,建立了一种用于检测类鼻疽菌的实时荧光定量PCR方法,该方法灵敏度高,特异性好,同时具有较好的重复性,可用于对类鼻疽菌的快速定量测定。【研究方法】（1）采用PacBio（?）RS II System对BPC006进行全基因组第三代测序,使用SPAdes-3.5.0软件进行Pac Bio数据拼接,通过软件Prokka预测拼接结果中的基因;通过软件RNAmmer 1.2、tRNAscan-SE-1.23、Infernal-1.1rc4分别完成rRNA、tRNA的预测;通过RPS-Blast工具进行COG注释;Blast2GO算法进行GO功能分类;通过KOBAS工具进行KEGG注释;使用CRISPR recognition tool预测基因组中的CRISPR序列;使用PHASTER在线网站预测基因组中的前噬菌体序列。（2）采用（1）所述方法对临床同一病人分离的原发株（BP145A）和复发株（BP145B）进行全基因组第三代测序;通过多位点序列分型（MLST）、同源比对系统进化树、单核苷酸多态性（SNP）以及插入/缺失（In Del）分析鉴定两株不同临床分离株的亲缘关系及基因组中的主要变化;胞内生存实验检测两株不同临床分离株的细菌胞内存活能力差异;最后,通过双向电泳-质谱技术分析两株细菌全菌蛋白的表达变化。（3）采用q-PCR建立类鼻疽菌的分子诊断方法,以类鼻疽菌Ⅵ型分泌系统相关基因簇BPSS0109基因序列设计引物和探针,构建重组质粒作为DNA标准品,优化荧光定量PCR的退火温度、反应体系中各成分浓度等条件,并进行方法学评价。【实验结果】（1）BPC006基因组由2条染色体组成,共有7160682个DNA碱基对。其中染色体1约4004906 bp,G+C含量为67.96%;染色体2约3155776 bp,G+C含量为68.5%,1号染色体上共预测到3412个蛋白质编码基因;2号染色体上共预测到2434个蛋白质编码基因。该菌基因组G+C平均值为68.23%。1号染色体预测到3个16S rRNA基因、3个23S rRNA基因、3个5S rRNA基因以及52个tRNA基因;2号染色体预测到共1条16S rRNA基因、1条23S rRNA基因、1条5S rRNA基因以及7个tRNA基因;在1号染色体上共发现了13种DNA甲基化修饰序列,2号染色体上发现了9种DNA甲基化修饰序列;在1号染色体的2980445～2980667 bp位置发现一个CRISPR序列;在1号染色体上共鉴定出4个前噬菌体区域,其中1个完整,3个不完整,分别位于染色体1785173～1841115、1785173-1841115、3286429-3311113以及3338907～3346379区域;在2号染色体上鉴定出2个前噬菌体区域,其中1个完整,1个不完整,分别位于染色体的1997070～2022502以及2032887～2043511区域。（2）BP145B为BP145A的复发菌株,两株菌MLST分型均为ST58型;BP145A和BP145B均位于基于全基因组蛋白序列构建的的物种系统发育树的同一分支;在BP145B基因组中共有114个SNP和55个In Del位点;双向电泳-质谱结果表明,与BP145A相比,BP145B共有68个蛋白的表达发生了显著改变,且BP145B的胞内生存能力明显强于BP145A。（3）优化确定了检测BPSS0109基因的q-PCR反应条件:37℃处理10 min,95℃预变性3 min,95℃变性10 s,58.3℃退火40 s,进行40个循环;反应体系中各成分浓度为:Mg2+的浓度为3 m M,Taq DNA聚合酶的浓度为1 U/25μL,UNG酶的浓度为0.2U/25μL;上游引物及下游引物的浓度均为0.2μM,探针的浓度为0.4μM。方法学评价:该方法检测线性范围为3.67～3.67×10~5拷贝/μL;灵敏度为4.97拷贝/μL;批内变异系数（CV）小于5%;Ct值的阳性临界值为36.17;大肠杆菌、具核梭杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、泰国伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌均无特异性扩增,仅类鼻疽菌有特异性扩增,Ct值在18～35之间。【主要结论】（1）完成了类鼻疽菌BPC006全基因组第三代测序分析,并对课题组2012年完成的第二代测序数据进行了校正,为类鼻疽菌的分子流行病学、感染机制研究及诊断提供了更为坚实的分子基础;（2）比较基因组学分析并结合双向电泳-质谱分析、胞内生存实验表明,类鼻疽菌可能在宿主的长期选择性压力作用下微进化,通过基因和蛋白表达调控使其更加适应于宿主体内的生存从而实现长期滞留;（3）成功建立了基于细菌Ⅵ型分泌系统相关基因BPSS0109基因的类鼻疽菌实时荧光定量PCR检测方法,该方法定量准确、灵敏度高、特异性强,可作为该菌实验室研究和临床检测的有效工具。