DERA酶的原核表达及阿托伐他汀钙手性中间体的生物合成

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阿托伐他汀钙是可以同时降低总胆固醇和甘油三酯的药物,属3-羟基-3-甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。目前阿托伐他汀钙手性中间体的合成方法有两种,一种是化学合成法即外消旋混合物的手性拆分,另一种是生物催化法。但是,化学合成法需要使用危险性或高毒性物质和昂贵化合物,而且合成步骤繁琐、原料利用率低、产物中杂质较多、污染物排放严重。目前,生物合成法越来越被重视,其中用的最多的方法是2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DeoxyribosePhosphateAldolase,DERA)催化。  枯草芽孢杆菌UD-20(Bacillussubtilis.UD-20)为本实验室分离的植物内生菌,具有DERA酶活性。本研究利用PCR技术从该菌基因组DNA中扩增得到DERA酶基因核苷酸序列。该核苷酸序列的大小为672bp,编码的蛋白含有223个氨基酸、pI(等电点)为5.04、理论分子量约为23.23KDa。用在线分析软件ClustalW对该氨基酸与GenBank中已登录的其它来源的DERA酶氨基酸序列进行多重比对,结果显示该氨基酸与Bacillussubtilissubsp,subtilisstr.SC-8(WP_003227127.1)、Bacillussubtilissubsp.spizizeniistr.W23(YP_003868275.1)和Bacillussubtilissubsp,subtilisstr.168(CAA57662.1)的相似性均达到98%以上。将Bacillussubtilis.UD-20DERA氨基酸序列和模板编号(PDB:3ngj.1.A)一并提交到SWISS-MODEL进行同源建模。通过对该模型的观察发现该酶涉及到的活性位点Cys47,Asp89,Lys152和Lys181在其它来源的DERA酶中完全保守,具有经典的TIM(α/β)8桶结构,属于TIM-phosphate-binding超家族中的Deoc家族,其中形成Schiff碱的活性Lys残基在β6侧链上,磷酸结合位点位于β7的末端。  将克隆到的DERA基因用BamHⅠ和HindⅢ内切酶消化并与同被BamHⅠ和HindⅢ酶消化的表达载体pET32a连接,构建重组表达质粒pET32a-DERA,并将重组质粒转入感受态大肠杆菌Rosetta中,经过诱导物(IPTG)诱导获得了DERA酶的高效表达。对重组DERA酶酶活力进行初步检测,结果显示,酶活力可达0.32U/g(湿菌体,以下均同)。表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析,蛋白图谱显示pET32a表达系有1条大约为43.4KDa的特异性条带。  本研究从温度、IPTG浓度和诱导时间三个因素对重组DERA酶基因工程菌发酵产酶的影响进行试验,并在单因素试验的基础上设计了响应面优化试验。单因素优化试验结果表明该菌发酵的优化组合为:发酵温度为26℃、IPTG浓度为0.1mM,诱导时间为10h,在此条件下发酵,酶活力可达2.4U/g,是初始酶活的7.5倍。经过响应面设计实验及回归方程分析,诱导时间对产酶的影响不显著,最终得出最佳的诱导温度为26.5℃,最适的IPTG浓度为0.11mmol/L,诱导时间为10h。在此发酵条件下,酶活力可达2.6U/g,是初始酶活的8.2倍。响应面优化的结果与回归方程分析得出的理论值高度拟合。  酶学性质研究表明,DERA酶最适反应温度和pH值分别为40℃和8.0;该酶在35-45℃范围内酶活力比较稳定,在50℃保温30min后,DERA的酶活仍可以保留25.71%,但是在65℃-70℃保温30min后基本没有酶活;在pH8.0条件下DERA的酶活力最稳定,pH6.0-10.0范围内25℃保温15min后酶活均能保留46.86%以上,pH7.0-9.0范围内保温15min酶活均保留53.13%以上,表明该酶在pH7.0-9.0环境下稳定性较好。Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Ba2+具有促进DERA酶活的作用,其中Ca2+的激活作用最强,该酶活力提高约29.8%;Mn2+、Co2+和EDTA对该酶有抑制作用,相对酶活力为89.1%、68.6%和87.2%;经过Cu2+、Fe2+和Zn2+处理的DERA酶的相对酶活力仅保留44.2%、51.9%和37.5%。  利用全细胞催化的方法催化氯乙醛和乙醛,利用气相色谱-质谱联用仪检测生物催化的产物。结果显示,主要产物为三聚乙醛,但拟合度仅为83%,结果还需用核磁共振的方法进行验证。
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