背景: 器官移植是终末期器官功能衰竭的重要治疗手段，移植排斥反应是影响其预后的关键因素。理论上，诱导针对移植抗原的特异性免疫耐受是防治移植排斥反应的最佳途径，其优点是：明显提高移植术成功率；避免免疫抑制剂所致的毒副作用和继发感染；降低医疗耗费。因此，诱导移植耐受成为移植免疫学研究的热点。移植免疫耐受是机体免疫系统在接触某种移植物后所产生的免疫反应不损害移植物。诱导移植免疫耐受的前提是：①使受者免疫系统接触供者移植抗原；②对受者免疫系统进行调控，使其耐受供者抗原。目前诱导移植耐受的方法主要有：1）阻断协同刺激信号通路；2）T细胞清除：即清除周围和中枢淋巴组织的淋巴细胞；3）混合性嵌合体建立，等等。但是这些方法都有很大的局限性。本实验室多年来一直研究凋亡细胞与免疫耐受，提出“供者凋亡细胞输注诱导免疫耐受”理论。 细胞凋亡是一种基本生命现象，是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程。细胞凋亡广泛参与机体病理生理过程，并在自身免疫病、病毒感染、肿瘤和肝脏免疫中起重要作用。近10年来，凋亡细胞对免疫系统的调节作用受到高度关注。现已证明，凋亡细胞可诱导移植免疫耐受，但其机制尚未完全阐明。目前推测以下机制起重要作用：1）抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC）可快速摄取凋亡细胞：巨噬细胞（Mφ）或树突状细胞（DC）表面表达某些特异性受体，可通过识别凋亡细胞所携带相应抗原而快速摄取凋亡细胞。吞噬凋亡细胞后，吞噬细胞内NF-κB信号传导通路被阻断，抑制促炎因子的产生，同时阻断IL-12、Th17细胞相关因子IL-17、IL-23的释放；2）APC可更有效地提呈凋亡细胞所携带的供者抗原：由于凋亡细胞表达特异性吞噬信号“eatmesignal”，使其所携带的供者抗原被特异性地浓集于受者APC内，因而能在短时间内提供大量供者MHC抗原，故能更有效地被受者APC提呈给T细胞；3）凋亡细胞抑制DC成熟。由于未成熟DC表面表达的分子如MHCⅠ、MHCⅡ、CD86及其它黏附分子水平低下，因而未成熟DC在向T细胞提呈抗原时不能提供充分的共刺激信号，从而可以诱导免疫耐受；4）凋亡的中性粒细胞和T细胞可能隔离趋化因子以阻止炎性细胞的募集；细胞死亡诱导剂、桥接凋亡细胞与吞噬细胞的可溶性因子、介导凋亡细胞被吞噬的配受体等都参与凋亡细胞诱导免疫耐受的过程；5）局部微环境的作用：凋亡细胞被APC摄取后，可调节APC功能、促使APC分泌免疫抑制因子并诱生调节性T细胞。 机体通过多种复杂的调节机制维持免疫自稳，预防自身免疫的发生和调节病原体及环境因素引起的炎症反应。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在不同的机制中起主要作用，是外周耐受主要的调节因素。CD4+CD25highT细胞亚群具有免疫调节功能，是机体内调节性T细胞的主要类型。 最近几年，关于Treg调节免疫抑制的作用分子和机制被广泛研究，并取得了重要进展。关于Treg的免疫调控机制主要有四种“作用方式”：抑制性因子的抑制作用；细胞溶解的抑制作用；代谢崩溃的抑制作用；通过调节DC成熟或功能的抑制作用。 环孢霉素A（Cyclosporin A，CsA）和雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）是器官移植术后预防排斥反应的常用药。免疫抑制剂减少免疫细胞的增殖和活化，进而抑制移植排斥反应，其分子机制是：CsA主要与嗜环蛋白（cyclophilin）形成复合物，抑制钙调磷酸酶（calcineurin）的活化，阻碍NFAT的去磷酸化与核转位，从而阻断IL-2的转录和T细胞的活化。Rapa则与FKBP12结合形成Rapa-FKBP12复合物，后者作用于靶蛋白mTOR（mammalian target of rapamycin，mTOR），抑制mTOR的作用，阻断T淋巴细胞从G1期到S期的进程。应用免疫抑制药物可以有效地控制移植排斥反应，延长器官的存活时间。 免疫抑制剂已在临床得到广泛应用，在探讨输注供者凋亡细胞而诱导移植耐受的临床应用前景时，须充分考虑免疫抑制剂对此干预策略的影响。阐明不同免疫抑制剂对凋亡细胞致耐受作用的影响具有重要意义，可为临床实践中联合应用免疫抑制剂和输注供者凋亡细胞联合治疗提供依据。所以，为初步探讨常用免疫抑制剂是否能促进凋亡细胞诱导调节性T细胞生成的能力，并研究其可能机制。设计以下实验研究内容，包括三部分： 第一章、凋亡细胞输注诱导小鼠体内调节性T细胞的产生。 目的：建立诱导小鼠胸腺细胞凋亡的试验方法，探讨输注凋亡细胞对体内调节性T细胞的作用及可能机制。 方法：将雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组，饲养在SPF级饲养柜中，饮用水和饲料均经灭菌处理。实验组小鼠静脉输注1．0×108个/ml×200ul小鼠胸腺凋亡细胞；对照组小鼠输注等体积的无菌PBS液。2周后戊巴比妥腹腔注射麻醉，无菌条件下经眼球采集外周血，肝素抗凝，备用。分离脾脏和胸腺，用RPMI-1640培养液重悬细胞，分别加入FITC-CD4单克隆抗体和PE-CD25单克隆抗体后，流式细胞仪检测CD4+CD25highT细胞。 结果：输注凋亡细胞后胸腺、脾脏和外周血中CD4+CD25highT在CD4+T细胞的比率分别为0．650±0．073%、、4．340±0．338%，3．848±0．363%；而PBS对照组的比例为0．376±0．087%、3．426±0．100%、0．952±0．060%、2．762+0．186%，两者之间差异均有统计学意义（P<0．05）。 结论：凋亡细胞能诱导体内调节性T细胞生成，从而可以诱导免疫耐受预防移植排斥的发生，为“凋亡细胞输注诱导免疫耐受”这一理论提供实验依据。 第二章、免疫抑制剂对小鼠体内调节性T细胞的影响。 目的：探讨免疫抑制剂环孢素A和雷帕霉素分别对小鼠体内调节性T细胞的作用及机制。 方法： （1）选择雄性8周龄C57BL/6小鼠20只，随机平均分为两组。实验组小鼠腹腔注射环孢素A20mg．kg-1．d-1×2周，对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS×2周； （2）选择雄性8周龄C57BL/6小鼠20只，随机平均分为两组。实验组小鼠腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周，对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS×2周； （3）2周后，各组小鼠在无菌条件下经眼球采集外周血，并分离脾脏和胸腺，制备单细胞悬液，流式细胞仪检测调节性T淋巴细胞。 结果： 1．CsA处理的小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞悬液中CD4+Foxp3+T淋巴细胞在CD4+T细胞的比率分别为6．211±0．793%、11．200±0．513%和0．628±0．025%；而在PBS组小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中分别为1．860±0．805%、15．360±0．683%和2．122±0．107%，各组的差异均有统计学意义（P<0．001）。 2．Rapa处理组C57小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞CD4+CD25highT细胞比率在CD4+T细胞的比率分别为6．280±0．275%、12．930±1．608%、9．880±0．484%，对照组C57小鼠外周血、脾细胞和胸腺内分别为5．780±0．528%、7．720±0．921%、2．430±0．284%，差异有显著性（P<0．01）。Rapa显著减少中枢淋巴器官和外周淋巴器官中CD4+T的数量，相对增加CD4+CD25highT细胞在CD4+T细胞中的百分比。 结论： 1、CsA损害调节性T淋巴细胞的发育，从而减少小鼠体内调节性T淋巴细胞的数量，从而降低免疫耐受的诱导作用； 2、Rapa不影响调节性T细胞的发育，而是抑制其它CD4+T淋巴细胞亚型的发育，Rapa这种对CD4+CD25highT细胞和非CD4+CD25highT细胞的不同作用将有利于移植患者诱导免疫耐受。 第三章、雷帕霉素对凋亡细胞输注诱导调节性T细胞的作用及机制。 目的：探讨免疫抑制剂雷帕霉素对凋亡细胞输注诱导体内调节性T细胞生成的作用及机制。 方法：将8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机平均分为3组：第一组为凋亡细胞处理组、第二组为雷帕霉素处理组、第三组为凋亡细胞与雷帕霉素联合处理组。小鼠饲养在SPF级饲养柜中，饮用水和饲料均经灭菌处理。第一组小鼠静脉输注1．0×108/ml×200ul凋亡细胞；第二组小鼠腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周；第三组给予静脉输注1．0×108/ml×200ul凋亡细胞，同时给予腹腔注射雷帕霉素1．5mg．kg-1．d-1×2周。2周后，用流式细胞仪检测CD4+CD25highT细胞。 结果：经凋亡细胞、雷帕霉素单独处理和凋亡细胞与雷帕霉素联合处理2周后，小鼠外周血CD4+CD25highT细胞在CD4+T细胞的比率分别为：8．000±0．855%、5．540±0．235%、4．040±0．708%；脾脏细胞中分别为：4．320±0．338%、6．180±0．359%、8．380±0．557%；而胸腺分别为：0．650±0．073%、1．420±0．165%、2．120±0．215%，各组的差异均有统计学意义（P<0．05）。 结论：雷帕霉素与凋亡细胞在诱导免疫耐受中可能存在协同作用，可在临床实践中联合应用雷帕霉素和输注供者凋亡细胞有可能预防及治疗移植排斥。