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研究目的:硫化氢(H2S)作为一种新型的气体信号分子,具有广泛而重要的生物学作用。H2S可通过内源性途径,如通过胱硫醚β-合成酶(CBS)合成,但脑缺血对内源性H2S生成有何影响尚不明确。H2S可调节脑缺血后的神经炎症,但具体机制尚不明确。本课题组前期研究表明在LPS诱导的中枢神经炎症模型中,H2S通过激活AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶),选择性诱导小胶质细胞向M2表型极化。基于前期研究,本课题的目的是探讨脑缺血对内源性硫化氢合成途径的影响,以及脑缺血后H2S能否通过激活AMPK促进小胶质细胞M2极化从而抑制中枢神经炎症,并减少急性期的脑梗死体积和促进长期神经功能恢复。为了增加此项研究在转化医学中的应用性,我们探讨了临床上作为保肝药和抗口腔干燥药茴三硫(ADT)是否与ADT-OH在脑缺血后在胶质细胞的极化作用上表现出相似的作用。ADT-OH是ADT的羟基化衍生物,并且ADT在体内几乎完全代谢成ADT-OH,表明ADT有可能作为ADT-OH的前体药物。因此ADT可能都可作为体内外的一种H2S供体而发挥作用。研究方法:在细胞水平上,收集神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)处理后的细胞培养上清,以此条件上清处理BV2小胶质细胞或原代小胶质细胞,来模拟体内脑缺血后小胶质细胞的激活。利用缓释H2S供体研究H2S选择性诱导小胶质细胞M2极化的机制。应用Western Blot技术检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活化(磷酸化)、胱硫醚β-合成酶(CBS)以及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表达;通过实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)技术检测M1(促炎状态)/M2(抗炎状态)细胞因子的表达变化;通过免疫荧光技术(Immunofluorescence)观察小胶质细胞的形态变化;通过小胶质细胞的吞噬能力以评价小胶质细胞的极化状态。在动物水平上,利用小鼠MCAO模型和光化学诱导脑缺血模型检测H2S供体对急性期脑梗死体积的影响;利用免疫组织化学技术(immunohistochemistry)检测M1/M2细胞因子标志物(CD16/32,CD206)与小胶质细胞标志物(Iba1)的共定位情况;并检测脑缺血后皮层组织H2S的合成能力;应用Western Blot技术检测皮层组织AMPK活化(磷酸化)、CBS以及CSE的表达;通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测皮层组织M1(促炎状态)/M2(抗炎状态)细胞因子的表达变化。利用下述行为学实验:左肢触碰实验(left paw placement test);错步实验(foot-fault test),前肢不对称测试或圆筒试验(cylinder test),前肢食物小球抓取实验(reach for food test),检测溶剂注射组和外源性缓释硫化氢供体注射组小鼠的神经功能的恢复状况。结果:在细胞模型上:1.Western Blot和Q-PCR结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞,其内源性CBS表达水平显著降低,CSE表达水平没有明显变化。2.用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞,其上清液中H2S含量极低,表明在此条件下,小胶质细胞H2S合成能力显著降低。3.Q-PCR结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞时,H2S供体ADT可抑制M1极化代表因子(IL-1β,IL-6,i NOS,TNF-a and CD32)的表达,促进M2极化代表因子(ARG and CD206)的表达。4.Western Blot结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞时,H2S供体ADT可增加AMPK的活化水平。5.免疫荧光结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞时,小胶质细胞呈现M1极化时的圆形,而H2S供体ADT可促进其转化为M2极化时的细长的双极形态。6.吞噬结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理小胶质细胞时,H2S供体ADT增强了小胶质细胞的吞噬能力。7.Western Blot结果表明:在缺氧缺糖条件下,星形胶质细胞以及混合胶质细胞CBS表达水平明显降低,CSE表达水平没有明显变化。然而,ELISA结果表明:用缺氧缺糖神经元条件上清处理星形胶质细胞时,不能诱导促炎介质(IL-1β)的表达。此外,H2S供体ADT/ADT-OH不影响星形胶质细胞中M1型代表因子的表达。这些结果表明:H2S可能主要是通过小胶质细胞而不是星形胶质细胞发挥脑缺血后的神经炎症抑制作用。在动物模型(MCAO)上:1.Western Blot结果表明:小鼠MCAO之后,缺血侧皮质CBS表达水平显著降低,CSE表达水平没有明显变化。2.H2S合成能力检测结果表明:小鼠MCAO之后,缺血侧皮质组织中H2S合成能力显著降低。3.Q-PCR和ELISA结果表明:小鼠MCAO之后,H2S供体抑制了缺血皮质中M1型代表因子的表达,促进了M2型代表因子的表达。4.在MCAO和光化学损伤诱导脑缺血模型上,脑缺血后补充外源缓释H2S供体,不仅降低了急性期的脑梗死体积,还促进脑缺血之后长期的神经功能恢复。5.Western Blot结果表明:小鼠MCAO之后,缺血侧皮层组织中AMPK活化水平均升高,而H2S供体可进一步增加AMPK的活化。6.免疫组化共定位结果表明:小鼠MCAO之后,H2S供体既可显著减少小胶质细胞M1极化代表因子标志物(CD16/32)与小胶质细胞标志物(Iba1)共定位阳性细胞数,又可使M2极化代表因子标志物(CD206)与Iba1共定位阳性细胞数增加。结论与创新:我们的结果表明脑缺血抑制了小胶质细胞中CBS介导的内源性H2S合成;而脑缺血后补充H2S可通过AMPK激活促进小胶质细胞M2极化,调控脑内神经炎症应答,从而降低急性期的脑梗死体积并促进长期神经功能恢复。