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肺癌是我国死亡率最高的癌症,其中约85%的肺癌是非小细胞肺癌。肺癌治疗中,为了增强疗效,联合用药是临床中最常用治疗手段。天然产物黄酮类化合物毒性低,但其抗肿瘤活性相比化疗药物差,难以单独开发成抗肿瘤药物。因此,本论文将无毒浓度下的黄酮类化合物与常用化疗药物(阿霉素和顺铂)联合,研究黄酮类化合物对化疗药物抗非小细胞肺癌活性和相关机制的影响。为黄酮类化合物联合化疗药物在治疗肺癌中提供理论依据和技术支撑。主要工作如下:(1)药物组合的筛选:采用人非小细胞肺癌A549细胞和人正常胚肺成纤维MRC-5细胞,通过MTT方法测定黄酮类化合物芦丁、牡荆素、槲皮素、染料木素、芹菜素、金合欢素对A549细胞的细胞毒性,将无毒浓度的黄酮类化合物与不同浓度的化疗药物(阿霉素和顺铂)联合作用于A549细胞,绘制化疗药物单独组和联合组的细胞存活率曲线。根据细胞存活率曲线的比较,得到金合欢素(5μg/m L)与阿霉素联合效果最强。通过测定此药物组合在MRC-5细胞中的细胞毒性,发现金合欢素(5μg/m L)未改变阿霉素对正常细胞的毒性。因此金合欢素联合阿霉素能显著增强阿霉素抑制A549细胞的增殖能力,提高阿霉素的药效,但对正常细胞无影响。在细胞单克隆实验中,与阿霉素单独组相比,金合欢素与阿霉素联合组的细胞克隆形成斑点数目显著减小,表明金合欢素能显著增强阿霉素抑制A549增殖的能力。因此将其做后续研究,从细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭方面进一步探究金合欢素对阿霉素抗非小细胞肺癌A549的活性及相关机制的影响。(2)细胞形态学观察、AO/EB双染色、Hoechst 33258染色的结果表明,与单独组相比,联合组凋亡细胞数目比例显著增加,A549细胞凋亡水平显著增加;通过流式细胞仪凋亡检测可观察到,与单独组相比,联合组中早凋细胞与晚凋细胞比例显著增多。以上结果均表明金合欢素增强了阿霉素诱导A549细胞凋亡的作用。随后对凋亡作用机制进行探究,线粒体膜电位、ROS水平的检测结果表明,与阿霉素单独组相比,联合组的线粒体膜电位下降,ROS水平增高。通过Western blot检测p53、p-p53蛋白,p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白,外源性通路相关蛋白:Fas、Fas L,内源性通路相关蛋白:Bax、Bcl-2、Cyt C、Apaf-1,Caspase家族:Caspase 3、8、9的蛋白表达量。结果表明:与阿霉素单独组相比,联合组能增强Fas L蛋白表达,通过Fas L/Fas途径激活Caspase 8,从而增强外源性凋亡。此外,通过Fas L/Fas激活p-p38 MAPK(p-p38 MAPK上调),随后增加p53的磷酸化(p-p53上调),磷酸化的p53活性增强激活p53通路,从而增加Bax/Bcl-2的比值和ROS水平,导致线粒体膜通透性增加,线粒体膜电位下降,释放Cyt C,与Apaf-1结合后激活Caspase 9,导致内源性凋亡。外源性凋亡通路与内源性凋亡通路都可激活Caspase 3,从而增强A549细胞凋亡。综上,联合组通过激活Fas L/Fas/p38 MAPK/p53通路,显著增强阿霉素诱导A549细胞凋亡作用。(3)通过流式细胞仪细胞周期检测,与单独组相比,联合组G1期比例显著上升,G2期、S期比例下降。Western blot检测分析中,p53活性增强,显著上调了p21蛋白表达量,表明金合欢素与阿霉素联用能对细胞周期产生影响;对G1期检查点Cyclin E-CDK2蛋白表达量进行检测,联合组表达量显著下降,CDK4无明显变化,CDK6表达量下降但无显著性差异,表明联合组能通过激活p53/p21,抑制Cyclin E-CDK2蛋白复合物活性,从而显著增强阿霉素对A549细胞G1期的阻滞。(4)通过细胞划痕实验,Transwell小室迁移、侵袭实验,观察金合欢素与阿霉素联合组和阿霉素单独组对细胞迁移和侵袭能力的影响。与单独组相比,联合组细胞划痕距离增大,细胞迁移、侵袭数目显著降低。Western blot检测分析中,联合组与阿霉素单独组相比,MMP-2蛋白表达量显著降低,E-cadherin蛋白表达量显著上升,表明联合组能通过下调MMP-2和上调E-cadherin,显著增强阿霉素抑制A549的侵袭迁移能力。综上所述,与阿霉素单独组相比,金合欢素(5μg/m L)与阿霉素的联合组能显著增强对A549细胞增殖的抑制能力。联合组通过激活Fas L/Fas/p38MAPK/p53通路,显著增强阿霉素诱导A549细胞凋亡作用;联合组能通过激活p53/p21,抑制Cyclin E-CDK2蛋白复合物活性,从而显著增强阿霉素对A549细胞G1期的阻滞;联合组能通过上调MMP-2和E-cadherin,显著增强阿霉素抑制A549的迁移和侵袭的能力。以上研究为金合欢素联合阿霉素在治疗非小细胞肺癌的应用提供了理论依据和数据支撑。