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研究背景和目的:慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,主要特点是具有BCR/ABL融合基因。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)伊马替尼,尼罗替尼等作为分子靶向药物,在治疗CML中已经取得了显著的效果。但是随着治疗的进行,约有15%-25%的病人逐渐对TKIs产生耐药。一些慢性期病人存在原发性耐药。存在BCR-ABL激酶位点突变时,特别是T3151突变,40%的病人对TKIs产生耐药。这些耐药现象的发生具体机制尚不十分清楚。近年来大量研究表明,骨髓微环境在白血病的耐药中发挥重要的作用。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中最重要的细胞之一,不仅可分化成各种各样的基质细胞如脂肪细胞、成纤维细胞等,而且可以分泌细胞外基质蛋白,细胞因子,生长因子等。IL-7是其分泌的细胞因子之一,能促进白血病细胞的DNA合成,与血液系统肿瘤的发生发展关系密切。本研究主要探讨慢性粒细胞白血病病人骨髓中IL-7的表达情况,并研究IL-7在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用及其机制。方法:1.收集24例慢性粒细胞白血病耐药病人(RCML)、非耐药病人(SCML)和健康人(NC)的骨髓,通过采用高灵敏的IL-7 ELISA检测试剂盒检测骨髓中IL-7表达水平,并用荧光定量PCR检测骨髓单个核细胞中IL-7基因的表达。2.采用Ficoll密度梯度离心法原代分离和培养慢性粒细胞白血病耐药病人骨髓间充质干细胞(RMSCs)、非耐药病人骨髓间充质干细胞(SMSCs)和健康人的骨髓间充质干细胞(NCMSCs),ELISA法检测RMSCs、SMSCs和NCMSCs培养液中IL-7表达水平。3.选用原代培养的NCMSCs、SMSCs和RMSCs在体外模拟健康人的骨髓微环境和CML病人的骨髓微环境,K562和BV173细胞株模拟CML白血病细胞,将白血病细胞与骨髓间充质干细胞共培养,构建出类似人体骨髓造血微环境对CML白血病细胞调控的模型。4.将NCMSCs,SMSCs和RMSCs按不同比例与K562/BV173细胞共培养,观察各组白血病细胞的增殖随MSCs浓度的变化。将NCMSCs,SMSCs和RMSCs与K562/BV173细胞共培养不同时间,观察各组白血病细胞的增殖随时间的变化。采用CCK8检测共培养的K562和BV173细胞的增殖。采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。在共培养组分别加入伊马替尼和尼罗替尼药物干预,AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡以及对TKIs敏感性的变化。采用Western blot检测BCR/ABL、PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。5.在RMSCs+K562共培养组,加入IL-7抗体或敲降RMSCs的IL-7基因,观察K562细胞在伊马替尼和尼罗替尼药物处理后,细胞增殖和凋亡的变化以及JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。6.将NCMSCs,SMSCs和RMSCs与K562细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠体内,建立皮下移植瘤模型,观察三种不同的骨髓间充质干细胞在体内对白血病细胞增殖、凋亡和耐药性的影响以及JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。结果:1.成功分离培养原代的NCMSCs,SMSCs和RMSCs细胞。三种MSCs形态相似,均为长梭形,成纤维细胞样,并呈漩涡状生长。流式细胞术鉴定所得细胞的免疫表型符合骨髓间充质干细胞的特点。2.ELISA检测结果显示,RCML病人骨髓中IL-7水平明显高于SCML病人和NC组。RMSCs培养液中,IL-7明显高于相应NCMSCs组和SMSCs组。3.荧定光量PCR检测结果显示RCML组骨髓单个核细胞中的IL-7mRNA的表达量明显增高。而SCML组与NC组相比,无显著性差别。4.共培养实验发现,不同MSCs对白血病细胞的增殖抑制呈浓度依赖性。低浓度的骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖无明显影响,高浓度的骨髓间充质干细胞能够显著抑制白血病细胞的增殖,而且随着间充质干细胞比例的升高,抑制作用增强。MSCs对白血病细胞增殖的影响呈现时间依赖性。随着时间的延长,MSCs对白血病细胞增殖的抑制作用增强。但是三种不同的骨髓间充质干细胞对白血病细胞的增殖抑制率无明显差别。5.细胞周期检测发现,随着共培养时间的延长,细胞周期发生了明显阻滞,S期的比例减少,G0/G1期细胞比例增加。但在K562+NCMSCs,K562+SMSCs,K562+RMSCs三个共培养组之间,无明显差别。6.加入IM或NI药物干预后结果显示,随着IM或NI药物浓度的增加,白血病细胞的增殖率逐渐减弱,凋亡率逐渐增加,NCMSCs、SMSCs和RMSCs三组均呈现这种趋势。但观察同一药物浓度下,各共培养组的增殖率发现,K562+RMSCs组,K562细胞增殖率明显高于对照组、NCMSCs和SMSCs组,而凋亡率明显低于对照组、NCMSCs和SMSCs组。在K562+RMSCs组加入IL-7中和抗体和敲降RMSCs的IL-7基因后,其增殖率下降,凋亡率增高。这些结果表明,RMSCs可以促进了酪氨酸激酶抑制剂处理后的K562细胞的增殖,抑制其凋亡,对K562细胞起到保护作用,这种保护作用与IL-7有关。7.采用Western blot检测相关信号通路蛋白的表达,结果发现RMSCs诱导的IM/NI耐药是BCR/ABL非依赖性的,且PI3K/AKT信号通路未参与,而是IL-7/JAK1/STAT5信号通路介导了RMSCs引起的慢粒白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂耐药。8.裸鼠皮下移植瘤实验表明,RMSCs能够保护白血病细胞,使其细胞凋亡减少,细胞存活增加从而促进其耐药,这种保护作用与Caspase 3和Bcl-2相关。进一步检测相关的信号通路,发现pJAK1和pSTAT5蛋白水平在K562+RMSCs皮下瘤块组织中明显高于其他组。敲降了RMSCs的IL-7基因后,瘤块组织中pJAK1和pSTAT5蛋白水平表达下降,提示IL-7/JAK1/STAT5信号通路参与了体内RMSCs促白血病细胞耐药作用。结论:慢性粒细胞白血病耐药病人骨髓间充质干细胞分泌IL-7异常增高,可通过BCR/ABL非依赖的方式,激活白血病细胞JAK1/STAT5信号通路,从而促进其对酪氨酸激酶抑制剂耐药,这可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的靶点。