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人载脂蛋白(a)[apolipoprotein (a),apo(a)]基因簇是研究真核基因表达调控的良好模型,而且其研究结果对临床有指导作用.升高的血浆脂蛋白(a)[lipoprotein (a),lp(a)]水平为动脉粥样硬化的一个主要危险因素,而研究表明它的表达水平主要由apo(a)的表达水平决定.基于目前众多的用于筛选和鉴定DNA调节片段的方法,我们采用了重组酶介导的片段交换(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)技术,利用重组酶的位点特异性重组特性,在基因组内的特定位点有效地进行靶片段与目的片段的交换.经典的RMCE过程分为以下三个步骤(1)靶载体(target vector)随机整合在细胞基因组上,靶片段的两侧为互为非相容性(mutually incompatible)的两种Lox序列,它们仅仅间隔区不同;(2)交换载体(exchange vector)与Cre重组酶表达载体共转染基因组内整合有靶载体的细胞株;(3)在重组酶介导下,交换载体上两种Lox序列间的交换片段与靶载体上的靶片段发生交换,实现在基因组的同一位点上交换片段的整合.通过Cre介导的RMCE技术,产生基因组的特定位点(artificial genomic loci,AGL),可以在特定的染色质环境下研究调控序列的作用机制,隔离子的功能,染色质的位置效应以及高效表达目的蛋白质等.该实验首先设计有相应酶切位点的引物,从人Apo(a)-Plasminogen基因簇BAC(DH 10B株)中扩增apo(a)启动子序列,与质粒pL1-HYTK-1L-SV40-EGFP-Neo进行定向连接,在报告基因EGFP和Neo的编码序列上游以313bp apo(a)启动子的核心序列替换SV40启动子.在该实验筛选出的稳定转化HYG-HepG2细胞系的基础上,可以进一步构建立换载体,行脂质体转化,GCV负筛选,流式细胞仪分析,进行apo(a)基因簇顺式元件(主要为增强子)的筛选和鉴定.同时这也是构建细胞芯片的基础步骤:细胞芯片技术是新近发展起来的一种高通量转化技术,利用反向转化的原理,在芯片上点样(载有交换片段的交换载体DNA)后,将细胞培养在芯片上摄入外源DNA,在芯片的原位检测转化信号,进行大规模的转化分析,从而进行高通量的顺式元件的功能分析.该实验在HepG2细胞中整合携带有互为反向Lox位点的靶载体,获得的HYG-HepG2细胞株,可作为受体细胞株(recipient cell strains)用于在特定的染色质环境下顺式作用元件的大规模筛选和功能研究.