论文部分内容阅读
背景:2’,3’-环核苷酸-3’-磷酸二酯酶（2’,3’-cyclic-nucleotide-3’-phosphodiesterase,CNP）一般被认为是一种髓鞘蛋白,主要存在于脊椎动物的中枢神经系统中。CNP主要包括CNP1和CNP2两个亚型,CNP1主要在神经细胞中表达,CNP2除了在神经细胞中表达以外也在其他细胞中有表达。目前对于CNP的具体功能和机制的阐述还不完全清楚,但已有的实验表明,CNP在髓鞘的生成、维持细胞表面形态、以及参与环磷酸腺苷（cAMP）代谢等方面起着重要的作用。CNP-Cre转基因小鼠能够在内源性CNP启动子控制下表达Cre重组酶。自从2003年Klaus-Armin Nave等人成功构建CNP-Cre小鼠以来,其被多次运用于少突胶质细胞中靶向敲除目的基因,研究基因对髓鞘及轴突的影响。本实验室用CNP-Cre小鼠和P110αflox/flox小鼠杂交,获得条件性P110α基因敲除小鼠(CNP-cre:P110αflox/flox)来研究PI3K通路对髓鞘发育和再生的影响。研究发现,CNP-cre:P110αflox/flox小鼠出生后第7天,髓鞘相关基因MBP mRNA水平明显下降,但在其他发育时间点无明显变化。与此同时,我们也发现该小鼠与正常小鼠相比,体重明显降低,且前期研究发现体重的减轻可能和小鼠肝脏及血清中FGF21的过表达有关。因此我们对CNP-cre:P110αflox/flox小鼠进行了进一步的研究,希望了解该转基因小鼠的髓鞘和体重表型并且进一步分析其分子机制。目的:（1）研究P110αflox/flox小鼠髓鞘形成障碍是否与体重的减轻有关;（2）研究条件性敲除P110ɑ,对小鼠的髓鞘再生造成的影响;（3）探究CNP-cre:P110αflox/flox小鼠体重降低（FGF21升高）的细胞生物学基础。方法:1)将基因型为CNP-cre的小鼠分别与P110αflox/flox和td-Tomato转基因小鼠杂交,获得CNP-cre:P110αflox/flox和CNP-cre:td-Tomato小鼠,进行后续实验;2)用双环己酮草酰双腙（cuprizone,CPZ）喂养实验小鼠,建立脱髓鞘模型,在脱髓鞘成功以后恢复正常饮食,进行髓鞘再生实验;3)用依来铬氰染色以及免疫荧光技术观察小鼠髓鞘形成和髓鞘再生情况;4)用原位杂交方法检测小鼠P7时MBP mRNA表达水平;5)用免疫荧光检测CD31,CD34和CNP的共表达情况;6)肝脏两步灌注法后差速离心分离得到肝实质细胞,检测FGF21的表达水平;7)用流式细胞仪检测肝实质细胞和肝脏内皮细胞中CNP阳性细胞的相对比例;8)用P110α抑制剂分别处理肝细胞系和内皮细胞系后,Q-PCR检测其FGF21的表达情况。结果:1)CNP-cre:P110αflox/flox小鼠体重明显降低,OLIG1-cre:P110αflox/flox小鼠体重没有明显的影响,但是CNP-cre:P110αflox/flox小鼠和OLIG1-cre:P110αflox/flox小鼠P7时脊髓中MBP mRNA水平均明显下降;2)CNP-cre:P110αflox/flox小鼠仅在P7时,其脊髓MBP mRNA和APC蛋白出现明显降低,其他发育时间点暂未发现明显变化;3)CNP-cre:P110αflox/flox小鼠成功建立脱髓鞘模型以后,其髓鞘恢复能力明显被抑制;4)在td-Tomato转基因小鼠肝脏冰冻切片实验中,发现CNP与内皮细胞标记物CD31和CD34有大量重合;5)流式细胞技术检测发现,肝脏非实质细胞中的CNP+细胞基本均为肝脏内皮细胞,而且肝脏内皮细胞中大约有三分之一是CNP+细胞,但是肝实质细胞中仅有百分之五左右的CNP+细胞;6)原代分离肝脏实质细胞后,检测FGF21的表达水平,结果发现CNP-cre:P110αflox/flox小鼠肝实质细胞中FGF21的表达水平明显降低;7)抑制P110ɑ,肝细胞系中FGF21水平均没有出现升高,但是内皮细胞系中FGF21表达水平显著升高。结论:1)CNP-cre:P110αflox/flox小鼠髓鞘形成障碍与小鼠体重降低无关。2)条件性敲除P110α,对小鼠髓鞘形成有一过性影响。3)P110α促进小鼠髓鞘的再生。4)FGF21在内皮细胞中有表达,且本研究的P110α基因敲除小鼠体重降低（FGF21的升高）,可能和内皮细胞有关。