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研究背景与目的:骨关节炎(OA)是骨科的常见疾病之一,是一种退行性关节疾病,其病因尚不明了。其中,长期超负荷的外力作用是较为公认的OA危险因素之一,因而在体重超重人群中,OA的发病率显著增加。瘦素(leptin)是一种白色脂肪组织分泌的小分子量蛋白,在体重超重人群中其血清含量往往升高。2003年Dumond等人发现OA患者关节液中瘦素(leptin)含量明显高于正常人,提示瘦素可能在OA的发病过程中起到某种作用。RhoA蛋白是调控细胞骨架的重要分子之一,OA软骨细胞与正常软骨细胞的显著差异之一就是细胞骨架含量的明显升高。本文拟通过荧光共振能量转移(FRET)法,研究活细胞条件下瘦素及外力刺激对于正常软骨细胞RhoA蛋白的作用,分别探讨瘦素、外力对于软骨细胞细胞骨架的影响,为OA的病因研究提供参考。研究方法:以编码YFP-RhoA-PKN-CFP融合蛋白的pRaichu-1237x质粒电转染正常人软骨细胞。观察在200ng/ml瘦素刺激下,RhoA蛋白的FRET信号改变。另外,应用原子力显微镜(AFM)作为施力工具,观察在AFM的轻敲模式与接触模式作用下,RhoA蛋白的FRET信号改变。研究结果:在200ng/ml的瘦素作用下,软骨细胞伪足迅速回缩,FRET信号逐渐减弱消失,直至最终细胞皱缩,形成许多细胞膜周围的小泡。软骨细胞在接受AFM轻敲模式刺激后逐渐出现胞质回缩,FRET信号明显增强,以接触探针刺激处最为明显。软骨细胞在接受AFM接触模式刺激后,细胞形态无明显改变,FRET信号明显增强,以接触探针刺激处最为明显。研究结论:(1)以大剂量瘦素(200ng/ml)刺激软骨细胞,不但不能激活RhoA蛋白,反而会使RhoA蛋白的FRET信号明显减弱,并导致软骨细胞逐渐皱缩,最终在细胞膜表面出现类似凋亡小体的小泡,提示大剂量的瘦素可能诱导软骨细胞的凋亡。(2)AFM作为施力工具可以直接给予体外培养的软骨细胞以力学刺激。以AFM的轻敲模式和接触模式作用于软骨细胞可以分别模拟垂直方向的压力和水平方向的剪切力。软骨细胞在AFM的外力作用下均发生了较强的FRET现象。细胞对于垂直方向的压力更为敏感,FRET信号更强,并出现了胞质回缩。提示外力作用可以显著激活细胞骨架的调控蛋白RhoA。