GBS文库限制性内切酶优化及其在巨桉气候适应性分析中的应用

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lishashasky
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全球气候变化加剧是全人类共同面临的重大挑战,而物种对气候变化的响应与适应直接影响陆地生态系统结构和功能的稳定性。生物长期以来随着生境条件不断变化而产生的适应性,对种质资源的长期保存以及育种策略的制定具有重大意义。全球变暖已经对全世界的生态系统和生物多样性产生了深远的影响,在全球气候变化加剧以及自然种群适应性机理仍尚未清晰的背景下,开展群体适应性研究已成为群体遗传学和进化生物学研究的重要内容。桉树种质资源丰富、遗传多样性较高以及较强的适应性,是开展适应性研究的理想树种。随着二代测序技术的快速发展,GBS技术以经济、简便、不依赖参考基因组等优点越来越多地应用于适应性研究,但不同物种的SNP开发效率与所选的限制酶紧密相关。本研究首先利用已有的ddGBS方案开展不同桉树的文库构建及SNP标记开发,并基于这些位点进行系统进化树构建,验证ddGBS技术在桉树中的适用性及其可靠性;然后利用巨桉(E.grandis)优化原有GBS建库限制性内切酶,并进一步应用于其他林木的GBS文库构建中;最终基于优化后的ddGBS对巨桉天然群体进行适应性分析,为深入理解桉树适应性机制提供分子依据。主要得到结论如下:(1)ddGBS技术高效发掘高质量SNP位点,可广泛用于桉树SNP开发,为桉树进化研究提供理论支持。通过对14个桉树树种进行ddGBS建库测序分析,开发高质量SNP位点,开展位点注释及核苷酸多样性分析,并且通过IQ-TREE软件采用最大似然法(ML)构建系统进化树。测序共获得30.49 Gb的数据,每个样品的平均数据量为1.09 Gb;共获得42 222个高质量SNP位点,其中14个桉树树种的特有SNP位点数为428~2 107不等,功能注释分析发现12 237个SNPs位于外显子区域。系统进化树结果显示,14个桉树树种聚类结果与Hill和Johnson的桉属双蒴盖亚属及伞房属的分类结果一致,可靠性较高。(2)本研究新酶组合ddGBS方案优化成功。在Poland等GBS方案(Msp Ⅰ-Pst Ⅰ组合酶)的基础上,筛选并优化出新的酶切组合(Msp Ⅰ-Mse Ⅰ)方案,通过对6个巨桉样品的对比试验,发现新酶组合方案在电子酶切的片段数、凝胶电泳酶切效率、SNP标记开发数以及标记在巨桉基因组上的分布密度均优于之前的方案,新酶方案在桉树中酶切效率和标记开发效率显著提高。表明了本研究ddGBS方法的优化成功,新的酶切组合将在林木群体遗传多样性、系统发育和分子标记辅助育种研究中具有广阔的应用前景。将优化后的方案应用于其他9个经济树种/药用树种:土沉香(Aquilaria sinensis)、木麻黄(Casuarina equisetifolia)、柚木(Tectona grandis)、青岗(Quercus dentata)、坡垒(Hopea hainanensis)、黑木相思(Acacia melanoxylon)、猴耳环(Archidendron clypearia)、米老排(Mytilaria laosensis)和交趾黄檀(Dalbergia cochinchinensis)构建ddGBS文库,并进行标记开发和多态性分析。结果显示:9个树种的测序数据覆盖倍数范围为0.39~9.29不等,开发标记数目为9 583~131 701,除青岗和黑木相思覆盖倍数不足0.5倍外,其它7个树种都接近1倍或以上覆盖度,猴耳环开发SNP标记数最多为62 114个(测序数据覆盖倍数约0.91倍),表明新方案在9个树种中的适应性较好,能高效发掘高质量SNP。此外,多态性分析表明巨桉在新方案表现出更高的核苷酸多态性,对9个树种也开展了SNP多态性分析。(3)基于优化后的ddGBS体系成功应用于巨桉群体SNP开发、分型及适应性分析,挖掘了多个与降水及温度关联的适应性候选功能基因。利用优化后新方案(Msp Ⅰ-Mse Ⅰ酶组合)对16个巨桉天然群体(137株样品)开发SNP位点,并开展遗传多样性、环境适应性和选择清除分析。共发掘出高质量SNP标记87282个,样品平均数据量约为2.1 Gb。巨桉群体整体上具有较高的遗传多样性(He均值为0.191、群体平均π值为0.206以及PPL%平均为70.576%),但遗传分化水平较低(FST平均值为0.054),且北方种源(5个)分化系数稍高于南方群体(0.064>0.046)。群体进化树分析结果显示,巨桉划分为两个群体。气候因子的Ward聚类结果也聚为南北两类,表明气候因子亦驱动了群体的分化。利用11个低相关气候环境因子的适应性分析显示:利用OA检测到390个FST异常值位点。GEA分析采取MLM、GLM和Farm CPU三个模型进行环境因子关联分析,发现GLM模型效果最优,取GEA与OA结果的交集53个位点作为适应性显著关联位点,其中有16个位点与至少2个环境因子显著关联。位于23个基因区域的53个位点经功能注释分析发现其中21个有明确功能信息,其中分别有9、7和6条基因与气温因子、降水因子和海拔显著关联。如同时与海拔和气温因子关联的位点,位于基因Eucgr.D02167(bio2/alt)和Eucgr.K03195(bio2/bio6/alt)上,注释功能分别为硝酸盐转运蛋白(NRT1.5)和蛋白激酶超家族蛋白,而植物蛋白激酶介导对高盐、干旱、低温、高温以及高渗透胁迫的应答,广泛参与植物的逆境响应过程,表明巨桉可能有适应未来气候急剧变化的潜力。本研究优化了ddGBS体系并应用于巨桉适应性研究,挖掘了巨桉群体环境适应性候选功能基因,初步解析群体适应性的遗传基础。研究结果为预测森林树种应对未来的气候变化提供依据,也为后期林木遗传改良提供坚实遗传基础。
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