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杜氏盐藻(Dunaliellasalina)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,可用于植物细胞耐受胁迫机制的研究。同时,盐藻具有较高的经济价值,并具有作为生物反应器在生物工程方面广泛应用的潜力。
盐藻与模式生物莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)同属于团藻,两者在形态结构乃至核基因密码子使用的偏好性方面都非常相似。本文借鉴莱茵衣藻的遗传转化方法,对盐藻遗传转化系统的建立作了如下探索:(1)通过电击法将外源ble基因转入盐藻细胞并对其瞬间表达进行了分析。在此基础上摸索出适宜的盐藻电击转化参数,并证明ble基因可以作为盐藻遗传转化的筛选标记。(2)参考瞬时表达得到的电击条件,将盐藻硝酸还原酶基因(nr)和博来霉素抗性基因(ble)共转化入盐藻硝酸还原酶突变体B14细胞中,利用nr基因作为内源互补筛选标记,ble做为待表达的外源目的基因,利用硝酸盐固体平板筛选、PCR、Southernbolt、NR相对活力测定和Westernblot等实验方法对选择标记基因的转化效率、双基因共转化效率、基因在受体细胞中的存留情况、表达情况等进行了探索。结果表明:nr基因可以作为盐藻遗传转化的选择标记。经过2轮筛选即可达到选择目的;利用电击法对于携带在2个质粒上的基因进行盐藻的共转化是可行的,nr、ble二基因的共转化频率约为41%以上,其共表达频率约为14.8%,尽管较低,但是能够得到有效的转化子;在6个月内,转入的nr基因和ble基因能够稳定、持续地成功表达。但是转入基因是否已经整合进盐藻的基因组中还有待于进一步的实验证据。