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自噬是指真核细胞依赖于溶酶体或液泡将细胞内含物,如损伤的细胞器和错误折叠的蛋白等生物大分子进行降解的过程。在植物中,细胞自噬的发生是由双层膜自噬体将胞内物质进行包裹,最后运输到液泡进行降解。近年来的研究表明,植物在遭受非生物胁迫和生物胁迫后都会诱导细胞自噬的发生;植物在低氧环境下活性氧(ROS)水平的升高常诱导细胞自噬的发生。淹水作为一种非生物胁迫,可诱导小麦根细胞ROS积累和通气组织形成,在此过程中ROS积累是否影响细胞自噬水平,以及不同耐湿性品种间是否存在差异还未见报道。本研究以耐湿性小麦品种华麦8号和不耐湿性小麦品种华麦9号为材料,利用细胞生物学和分子生物学技术探究淹水胁迫下小麦根通气组织形成过程中ROS积累对细胞自噬水平的影响,以及不同耐湿性品种小麦间ROS积累和细胞自噬水平差异。主要结果如下:1.qRT-PCR检测淹水胁迫下小麦根低氧相关基因(Ta ADH基因家族、Ta Hb基因家族和Ta PDC基因)的转录平,结果表明:低氧相关基因响应淹水胁迫的表达,表达量出现上调趋势,且华麦8号和华麦9号间低氧相关基因具有显著差异。乙醇脱氢酶(ADH)和丙酮酸脱羧酶(PDC)活性检测发现,淹水胁迫导致小麦根ADH和PDC活性升高,且华麦8号和华麦9号间具有显著差异。说明淹水胁迫诱导小麦根低氧相关基因的表达,促使淹水胁迫下低氧信号的传递。2.DAB、DHE染色和ROS超微细胞化学定位结果表明,与不淹水的对照相比,淹水胁迫诱导了ROS的积累,且华麦8号和华麦9号之间ROS的积累没有明显的差异。3.Western blot和qRT-PCR技术检测淹水胁迫下小麦根交替氧化酶(AOX)的蛋白表达水平和Ta AOX基因家族的转录水平,结果表明:淹水处理后华麦8号和华麦9号Ta AOX基因家族的表达量呈现先上升后下降趋势,总体上Ta AOX基因家族表达量华麦8号较华麦9号高。该结果说明小麦根Ta AOX基因家族响应淹水胁迫的表达,有助于减少淹水前期小麦根ROS的积累。两品种小麦间无明显差异。由此表明小麦根淹水胁迫后诱导了Ta AOX基因及AOX蛋白的表达,对淹水前期(4 h-8 h)的ROS积累具有一定的清除作用。4.qRT-PCR检测淹水胁迫下小麦根抗氧化酶相关基因(Mn-SOD、CAT、APX和GR)的转录水平,发现淹水处理后抗氧化酶相关基因的表达量出现明显的上调,总体上华麦8号抗氧化酶相关基因表达量较华麦9号高,且华麦8号和华麦9号间具有显著性差异。由此表明,小麦根抗氧化酶相关基因在淹水前期(4 h-12 h)响应,减少ROS的积累。5.透射电镜和激光共聚焦显微镜观察淹水胁迫下小麦根自噬相关结构(巨自噬、微自噬、自噬小体和自噬泡等)的变化,结果表明,淹水后期(24 h-48h)华麦8号和华麦9号根中都观察到自噬相关结构发生,细胞自噬首先发生在根中柱细胞,后发生在皮层细胞;在华麦8号中观察到微自噬和巨自噬结构,而在华麦9号中只观察到微自噬结构,华麦8号自噬相关结构较华麦9号多。qRT-PCR检测结果表明,淹水胁迫下华麦8号和华麦9号自噬相关基因(ATG)相对表达水平升高,且都是在淹水后期(24 h-48 h)达到最大值。由此表明,淹水胁迫诱导两品种小麦根细胞自噬的发生,华麦8号和华麦9号两品种间的差异表现在发生自噬结构的类型和数量上。6.FDA和台盼蓝染色观察小麦根细胞活力和细胞死活发现,随着淹水时间的延长(24 h-48 h),根细胞活力逐渐降低,死细胞逐渐增加。透射电镜观察发现淹水胁迫下华麦8号细胞核发生降解和形变,结构不完整,细胞器数目也明显减少;华麦9号细胞质浓缩,内含物减少,线粒体内部结构已经发生降解,说明该死亡过程为程序性细胞死亡(PCD)。7.ROS抑制剂(DPI)处理能抑制淹水胁迫下NADPH氧化酶的活性,减少细胞内总ROS的产生,自噬发生的水平也得到显著抑制。ROS促进剂(H2O2)处理后,ATG基因的表达明显上调,自噬相关结构数量增多。综上所述,淹水胁迫下小麦根呼吸爆发氧化酶(RBOH)活性升高,促进了小麦根细胞ROS的产生和积累,淹水前期(4 h-12 h)ROS的积累诱导了ROS清除相关基因表达量增加,对淹水前期积累的ROS具有一定的清除作用;淹水后期(24 h-48 h)小麦抗氧化能力减弱,ROS积累增多,进而调控ATG基因的表达量增加。研究进一步发现,淹水胁迫下ROS积累诱导小麦根自噬相关结构(巨自噬、微自噬、自噬小体、自噬泡等)的发生,且两品种小麦间细胞自噬的差异表现在自噬结构的类型和数量上,在华麦8号中观察到巨自噬和微自噬结构,而在华麦9号中只观察到微自噬结构,华麦8号自噬相关结构数量较华麦9号多。随着淹水胁迫时间的延长(24 h-48 h)小麦根细胞活力逐渐降低,由PCD诱导的死亡细胞增加,导致通气组织的形成。