论文部分内容阅读
食品加工和贮藏的过程中存在各种物理、化学因素会引起蛋白质的氧化。另外,脂质和糖类的氧化产物也会引发氨基酸残基侧链的多种氧化修饰,导致蛋白质结构发生变化,降低蛋白质的功能特性,甚至造成有害影响。在组成蛋白质的所有氨基酸中,酪氨酸（Tyr）残基极易发生氧化和硝化修饰,生成氧化酪氨酸产物（OTPs）。在肉制品和乳制品等高蛋白食品加工过程中,都检测到不同程度的OTPs。OTPs的主要成分包括双酪氨酸（Dityr）、三硝基酪氨酸（3-NT）、蛋白氧化终产物（AOPP）等。OTPs中大部分成分的化学结构稳定,对酸解和蛋白酶水解过程都有很好的抵抗性,其中,Dityr常常被作为判断食品中蛋白质氧化的标准。本实验室前期研发现食源性OTPs会引起小鼠机体的氧化损伤。另外,OTPs及其主要成分Dityr也可以穿过小肠肠壁被机体吸收,随着内循环进入各个组织器官,造成不同程度的损伤。然而,食源性OTPs引发机体出现氧化应激,如何影响能量代谢,包括糖代谢的平衡和胰腺正常功能及其相关机制等问题尚不明确。因此,研究食物中含有的OTPs和Dityr对机体血糖水平及胰腺正常功能的影响,对完善食物蛋白质营养理论,优化食品加工工艺,改善人类健康具有非常重要的理论和实际意义。本课题主要通过体外模拟实验探讨OTPs和Dityr的促氧化特性,并通过大鼠、小鼠,以及细胞模型探讨OTPs和Dityr暴露对于动物胰腺分泌胰岛素功能的影响及其相关分子机制。本研究选择H2O2-Cu体系氧化酪氨酸制得OTPs。运用电子自旋共振系统（ESR）对OTPs和Dityr的体外促氧化能力进行测评。结果发现OTPs和Dityr均可以诱导产生自由基,自由基种类包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、烷基自由基,以及一些无法识别的自由基。该结果说明OTPs和Dityr具有很强的促氧化能力。本研究采用雌雄大鼠7天单次灌胃实验对OTPs的经口毒性进行初步评价,发现OTPs属于无毒级别。然后,对雌雄SD大鼠进行28天重复灌胃实验以评价OTPs的体内积蓄性。对大鼠进行OTPs灌胃28天后,发现OTPs灌胃大鼠的空腹血糖均显著高于正常组,血浆胰岛素水平显著低于正常组。说明OTPs灌胃可能会影响大鼠胰腺分泌胰岛素的能力,引起高血糖的症状。本研究接下来通过6周、12周、24周饲喂实验研究食源性OTPs对大鼠血糖及胰腺胰岛素分泌能力的影响。饲料中OTPs的添加量为8 g/kg饲料。饲喂结果表明,不同周期OTPs饲喂均造成大鼠空腹血糖上升和血浆胰岛素水平下降,胰腺Dityr沉积增加。另外,大鼠血液中ROS水平显著上升说明OTPs饲喂引起大鼠氧化应激。大鼠机体各项指标的变化随着OTPs饲喂周期的延长而加剧。24周饲喂后,OTPs组大鼠上述指标与正常组大鼠差异最明显。本研究接下来针对24周OTPs饲喂对大鼠胰腺胰岛素分泌能力及引起的氧化应激进行了深入研究。为了证实OTPs是否通过氧化应激影响大鼠胰腺的正常功能,本实验还设置了抗氧化剂组,该组饲料中添加OTPs的同时,同时添加硫辛酸（LA）。饲喂第10周开始,OTPs饲喂组大鼠体重增长速率显著慢于正常组大鼠,采食量显著高于正常组大鼠,说明OTPs饲喂导致大鼠出现能量代谢紊乱现象。饲喂24周后,OTPs饲喂大鼠空腹血糖显著高于正常组大鼠,并且出现葡萄糖耐量下降和血浆胰岛素水平下降现象。OTPs饲喂大鼠胰腺与葡萄糖转运及糖酵解相关基因（Glut2、Gck）和胰岛素合成相关转录因子（Pdx-1、MafA）mRNA水平明显低于正常组大鼠,说明OTPs饲喂导致胰腺胰岛素合成能力下降。24周OTPs日粮饲喂导致大鼠机体出现氧化应激,血液ROS水平显著高于正常组大鼠,血液GSH/GSSG比值显著低于正常组,且出现了高水平的炎性因子（TNF-α和IL-6）,说明大鼠出现氧化还原状态失衡现象。另外,OTPs饲喂大鼠血液总抗氧化能力（T-AOC）减弱,胰腺抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）酶活减弱,脂质过氧化产物（MDA）和蛋白质氧化产物（Dityr和3-NT）积累增加,以及ARE/Nrf2通路基因（Nrf2、GPx-1、Ho-1）mRNA水平显著下降,说明OTPs饲喂引起大鼠胰腺氧化损伤,抗氧化能力下降。然而,添加LA后,大鼠血糖、血浆胰岛素水平,以及机体的氧化还原状态得到恢复,进一步说明OTPs会通过引起氧化应激影响胰腺胰岛素的分泌功能。Dityr是OTPs中的主要成分。本实验对C57BL/6小鼠进行短期10周的OTPs和Dityr灌胃实验,以评价Dityr在OTPs引起的胰腺氧化损伤中的作用。灌胃结果显示,纯Dityr灌胃对小鼠胰腺造成的氧化损伤与OTPs灌胃,以及长期OTPs日粮膳食摄入效果类似,引起小鼠空腹血糖升高,血浆胰岛素水平下降。说明日常膳食结构中,如果Dityr摄入过高,同样也会导致机体出现氧化应激,影响胰腺合成胰岛素的能力。本研究接下去进一步研究Dityr引起的氧化应激对胰腺胰岛素合成能力的影响。本研究对小鼠进行为期10周的Dityr灌胃。此外,本实验对小鼠胰腺瘤细胞MIN-6细胞进行Dityr暴露,并设置H2O2组为阳性对照组。结果发现,Dityr暴露导致小鼠血液及MIN-6细胞中ROS水平上升,Dityr暴露小鼠胰腺和MIN-6细胞与线粒体代谢和功能相关基因的mRNA水平均显著低于正常组小鼠或未暴露细胞,说明Dityr暴露导致胰腺三羧酸循环受损,ATP合成下降,KATP通道受阻,线粒体DNA（mt DNA）数量下降,影响胰腺β细胞对于葡萄糖的感应能力,以及细胞对葡萄糖的转运能力和糖酵解过程。另外,Dityr暴露导致小鼠胰腺和MIN-6细胞线粒体膜电位下降,出现线粒体膜去极化现象,表示线粒体膜完整性被破坏,引起线粒体内一些细胞凋亡因子和细胞凋亡信号外流进入细胞质内,诱导细胞出现凋亡。本研究认为,氧化应激引起的线粒体功能损伤,可能是Dityr引起的胰腺胰岛素分泌能力下降的关键因素之一。Dityr和甲状腺激素T3二者的化学结构非常相似。本研究通过计算机模拟技术发现,Dityr能够结合到甲状腺激素受体β1（TRβ1）上,且Dityr和T3在TRβ1上的结合位点相同。Dityr灌胃小鼠的血浆中T4和T3的水平均显著高于正常组小鼠,而血浆中TSH水平则没有显著变化。说明Dityr灌胃小鼠T4和T3对于TSH的负向调节作用可能被抑制。与此同时,Dityr灌胃小鼠血浆胰岛素水平,以及胰腺中与胰岛素合成相关基因（Ins2、MafA、Pdx-1）mRNA水平均低于正常组小鼠。细胞实验结果证实,T3能够显著上调胰腺细胞胰岛素分泌的能力。因此,本研究推测,Dityr灌胃导致T3对于胰岛素合成过程的调节作用被抑制。细胞实验结果证实,Dityr暴露导致细胞对于T3从胞外向胞内的转运过程下降。进一步研究发现,Dityr暴露引起小鼠胰腺和MIN-6细胞中TRβ1的蛋白水平以及和T3生理作用相关的共激活因子基因（Rxrα、Src-1）mRNA水平显著下降。本研究认为,Dityr通过下调TRβ1及其共激活因子,从而影响T3对于胰腺胰岛素合成的调节。另外,Dityr下调TRβ1的蛋白水平,并抑制ATP的合成,从而影响T3对Akt磷酸化的刺激作用,并进一步抑制T3对mTOR及其下游基因（eIF4E、S6K、4E-BP1）的调控作用,最终导致T3对胰岛素合成过程的调节。综上所述,食物来源的OTPs及其主要成分Dityr通过肠道进入血液后,会引起机体的氧化应激和炎症反应,抑制胰腺线粒体正常代谢过程,从而影响胰腺分泌胰岛素的功能。另外,OTPs及Dityr影响HPT轴正常功能,造成动物体能量摄入与消耗的失衡。Dityr通过抑制胰腺T3的转运能力,下调TRβ1及其共激活因子的表达,同时抑制T3刺激的ATP合成过程,降低T3对Akt/m TOR通路的激活作用,在调节胰腺合成胰岛素过程中与T3产生拮抗作用,影响T3对于胰腺胰岛素合成的调节。本研究证实,长期OTPs或Dityr摄入可能是引发糖尿病的风险因子之一,其中造成氧化应激和影响T3的正常生理功能可能在该过程中起到主要作用。