纳米二氧化钛(纳米TiO2)是一类新型的无机纳米材料,近年来被广泛应用于化妆品、服装、环境保护等领域。由于纳米TiO2具有较强的光化学活性,大量使用与人体皮肤接触,其皮肤安全性引起人们的广泛关注。目前,国内外关于纳米TiO2的毒性研究大都来自体外和短期的动物毒性实验,未见系统的纳米TiO2透皮行为及紫外光(UV)诱导下致皮肤损伤机制的研究。本论文研究了不同粒径(4-90nm),不同晶型(锐钛矿型、金红石型、混合晶型)纳米TiO2的离体、在体透皮行为以及器官蓄积；研究UV诱导下纳米TiO2产生活性氧自由基(ROS)的途径和对人角质形成细胞(HaCaT)的损伤机制；探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)降低纳米TiO2的氧化损伤效应。开展的主要工作如下：(1)采用水平透皮扩散池,研究纳米TiO2离体透皮行为,以乳猪和Bulb/c裸鼠为模型,研究纳米TiO2在体透皮行为。离体透皮结果表明：不同粒径及晶型的纳米TiO2均没有透过猪耳皮肤角质层,胶带剥离实验结果提示纳米TiO2主要沉积在皮肤表面的毛孔及褶皱中。在体透皮结果表明：乳猪猪耳皮肤在体透皮30 d后,通过透射电子显微镜(TEM)及病理组织切片观察,纳米TiO2可穿透猪耳皮肤角质层,进入表皮,且可进入表皮细胞胞浆内,并对细胞产生一定程度的损伤,主要表现为细胞核周围出现空泡及细胞间隙模糊,细胞间桥粒连接消失；Bulb/c裸鼠整体透皮60 d后,不同晶型及粒径纳米TiO2均不同程度的穿透裸鼠皮肤,进入皮下各组织和脏器中,并引起相应的组织病理学改变,主要表现为组织炎性细胞浸润及灶性坏死,裸鼠暴露皮肤出现褶皱加深、松弛、无光泽等老化现象,光镜下皮肤组织呈现表皮角化过度、表皮变薄及深层细胞萎缩等病理学改变,皮肤组织匀浆样品中羟脯氨酸(HYP)含量、超氧化物歧化酶(SOD)水平显著降低,丙二醛(MDA)含量明显上升。试验结果提示皮肤老化及损伤均与氧化应激相关。(2)采用噻唑蓝(MTT)法研究UV诱导下纳米TiO2的细胞毒性,采用流式细胞术、荧光分光光度法研究细胞凋亡、胞内ROS含量和线粒体膜电位(△ψm)的变化规律,TEM观察纳米TiO2在细胞中的分布。结果表明,UV诱导下纳米TiO2具有较强的细胞毒性,能够浓度依赖性地降低HaCaT细胞的存活率,UV诱导下纳米TiO2产生大量的ROS,引起HaCaT细胞的氧化损伤、细胞凋亡及线粒体△ψm的降低。实验中选用的不同粒径、不同晶型的纳米TiO2均可穿越细胞膜进入HaCaT细胞,并主要以团聚的形式存在于细胞的胞浆中。(3)通过加入线粒体呼吸链抑制剂,线粒体解偶联剂,线粒体通透性转换孔(PTP)抑制剂,研究UV诱导下纳米TiO2产生ROS的途径及损伤细胞的机制。结果表明,线粒体呼吸链抑制剂及氧化磷酸化解偶联剂均能明显影响纳米TiO2引起的细胞内ROS的产生；线粒体以外的ROS来源,如脂氧酶、环氧酶、NADPH氧化酶等对纳米TiO2诱导的细胞内ROS的产生没有明显影响；一氧化氮合酶催化代谢对纳米TiO2诱导的细胞内ROS的产生有一定程度的影响；PTP抑制剂环孢霉素A(CsA)能够抑制纳米TiO2的细胞毒性。上述结果提示,线粒体呼吸链可能是纳米TiO2致细胞内ROS过量产生的主要来源,线粒体通透性转变在纳米TiO2的细胞毒性中具有重要的作用。(4)通过加入抗氧化剂NAC预处理细胞,研究UV诱导下NAC降低纳米TiO2的氧化损伤效应。结果表明,NAC使细胞凋亡率显著性下降,明显抑制细胞胞内ROS的产生和蓄积,维持线粒体△ψm稳定,保护线粒体；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HaCaT细胞角蛋白6(Keratine 6)的表达,纳米TiO2可明显抑制Keratine 6的表达,而NAC能使其表达显著上调。结果提示NAC可通过拮抗胞内氧化应激损伤而降低纳米TiO2的细胞毒性。综上所述,本工作对纳米TiO2的皮肤安全性进行了较系统的研究。首次研究了纳米TiO2在乳猪猪耳皮肤和BALB/c裸鼠颈部皮肤上的长时间在体透皮行为,发现经长时间的皮肤暴露,未经修饰的纳米TiO2可穿越皮肤的角质层,产生器官蓄积并对皮肤及器官造成损伤。研究了UV诱导下纳米TiO2对皮肤细胞的损伤效应及机制,结果表明UV诱导下纳米TiO2诱发细胞内ROS的过量产生,损伤细胞膜及线粒体,引起线粒体损伤,从而诱导细胞凋亡；初次阐明了线粒体呼吸链是纳米TiO2致细胞内ROS过量产生的主要来源,线粒体通透性转变在纳米TiO2的细胞毒性中具有重要的作用；抗氧化剂NAC可以通过拮抗胞内氧化应激损伤而降低纳米TiO2的细胞毒性。研究工作为纳米TiO2的安全应用提供实验依据。