酶在合成有机化学和生物技术的应用上通常受到以下限制:(1)、由于酶作用的底物范围比较窄,许多我们需要的化合物不能被酶催化;(2)、酶的活性高,但是立体选择性较差;(3)、酶在催化条件下不稳定;(4)、产物抑制使得转化率低。在近10-15年间,定向进化技术发展起来。定向进化,有时又被称为实验室进化(试管中的进化),试图通过反复的基因突变、表达、筛选循环重复自然进化过程,直到筛选(或选择)到符合要求的生物催化剂。这一概念在一定程度上改变了传统采用“合理设计”构建定点突变的蛋白质工程方法。对来自鱼腥藻(Anabaena variabilis)中的苯丙氨酸解氨酶(AvPAL)进行合理设计,以低成本并且市场上可购买的反式肉桂酸(t-CA)为原料,大规模生产L-苯丙氨酸以及β-苯丙氨酸。通过计算机模拟(对接)的方法,得到两个突变体可以提高L-苯丙氨酸的产量,对突变体的氢键分析揭示了催化活性提高的原因。突变体所催化反应的反应速率,底物抑制以及动力学数据与野生型基本一致。根据我们的结果,Arg103突变体的酶活性相对于野生型AvPAL提高了 11倍。我们通过酶法,以低价的肉桂酸为原料,一锅法得到大量光学纯的β-苯丙氨酸。首先利用Omega软件,将苯丙氨酸解氨酶(PAL)序列与苯丙氨酸变位酶(PAM)序列进行比对,并比对PAL与PAM的结构,以及与辅因子4-甲基咪唑-5-酮(MIO)结合部分。通过比对,我们发现PAL与PAM的结合位点有所不同,因此,我们将AvPAL中结合位点 Ile165/Glyl66 与 Val105,突变为 PAM 中 Val173/Ser174以及Ile105。工程化的AvPAL可广泛应用于β-苯丙氨酸的生产。根据我们的结果,突变体I165V/G166S所催化的反应相对于野生型AvPAL,其产量提高了 70%。这个反应不需要专一辅因子或者循环系统,因此具有综合价值。定点突变是通过Quick-Change技术进行的,突变体测序由睿博测序公司完成。重组野生型AvPAL以及其突变体在大肠杆菌中表达,利用组氨酸标签纯化。比较突变体与野生型所催化反应的反应速率、底物抑制和突变酶动力学数据,发现突变体的性质并未受到影响。