论文部分内容阅读
水稻(Oryzasativa L.)是世界范围内主要粮食作物之一,土壤磷素的缺乏一直是限制水稻产量的重要因素。增施磷肥虽然可以提高水稻产量,但同时也会造成磷资源的大量消耗,环境污染以及增加生产成本。因此研究水稻响应低磷信号的分子和生理机制,对耐低磷水稻品种的选育具有理论与实践意义。本研究以低磷敏感型水稻通粳981为实验材料,通过转录组测序分析发现水稻OsLPR1、OsLPR3、OsLPR4和OsLPR5基因在低磷处理15天后呈现显著上调表达,说明OsLPRs基因家族可能与水稻磷稳态平衡相关。因此利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsLPR1、OsLPR3、OsLLR4和OsLPR5进行突变;以突变材料和野生型为实验对象,研究低磷胁迫对突变体与野生型水稻根系形态、生理和铁膜形成之间的差异,利用qRT-PCR技术对水稻根系中OsLPRs基因、根系生长调节因子在转录水平上进行检测验证。1.转录组测序分析结果通过对低磷胁迫15天的供试材料根系进行转录组测序分析,发现磷胁迫促使水稻OsPR基因家族呈现上调表达;qRT-PCR和蛋白组学结果验证了转录组测序结果的准确性。说明OsLPR基因家族可能参与水稻磷稳态平衡。2.突变体的构建与鉴定利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术对供试水稻的OsLPR1、OsLPR3、OsLPR4和OsLPR54个基因进行基因编辑。从102株组培苗中,经抗性基因筛选,筛选出39株阳性苗;对阳性苗的OsLPR3基因组靶位点鉴定后,发现有16株阳性苗在OsLPR3靶位点发生了基因编辑。在OsLPR3突变体中对OsLPR1、OsLP4和OsLPR5突变体进行筛选,鉴定得到12株4个OsLPR基因(OsLPR1、OsLPR3、OsLPR4和OsLPR5)均突变的植株,说明利用CDS的同源序列对多个基因进行基因编辑是可行有效的。此外还发现1株仅有OsLPR3基因突变的植株。脱靶位点的检测发现,12株突变体均没有发生脱靶。突变类型分析表明,有2株OsLPR1、OsLPR3、OsLPR4和OsLPR5都是纯合突变的株系。3.突变体根际铁膜的变化低磷(1/25 Pi)处理突变体和野生型水稻15天发现,突变体根系红棕色铁膜颜色比野生型水稻浅。DCB-Fe定量检测两者根系铁膜质量,发现突变体根表铁膜积累量较野生型显著减弱;同时正常供磷培养的突变体根表铁膜也显著低于野生型,说明OsLPR基因与根表铁膜的形成以及三价铁积累量相关。4.根系形态和生理指标差异随着低磷胁迫时间的延长,突变体的磷饥饿生理反应减弱,表现在根冠比显著降低、根系显著缩短,根数量和株高显著增加,说明OsLPR家族是水稻根系响应磷饥饿信号的重要组成。磷胁迫15天后,在地上部的总磷含量指标中,突变体较野生型显著增加,此外突变体根系分泌物中酸性磷酸酶活性比野生型增加13.64%,但没有显著差异,说明OsLPR基因可能不参与调控酸性磷酸酶合成与分泌。5.OsLPR基因及相关基因qRT-PCR分析qRT-PCR结果表明,在突变体水稻中OsLPRs(OsLPR1/3/4/5)仍存在转录表达,说明基因编辑后的OsLPRs没有提前产生终止子。低磷处理后,突变体水稻的OsLPR1/3/4/5相对于野生型表达量显著下降,与根系分生活性相关的转录因子SHR和SCR以及与胼胝质水解相关的β-1,3葡聚糖酶基因(Os03g0221500)转录表达也显著降低。说明在突变体根系中胼胝质的积累可能上升,从而抑制了根尖分生组织的分生活动,并最终导致突变体在低磷条件下表现出短根性状。综上所述,通过OsLPRs突变体的构建、根系形态差异、生理指标分析以及qRT-PCR检测,结果表明OsLPRs基因在低磷环境下参与根系铁膜的形成,并可能间接调控水稻磷吸收,直接参与水稻根系形态建成。