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乳腺癌已经成为现在世界女性最常见的癌症之一,其病死率在美国和西欧国家中最高。近年来我国乳腺癌的发病率呈现逐年升高的趋势,其中城市地区高于农村。在新发乳腺癌患者中,6%～7%的患者初诊即为进展期乳腺癌,而最初诊断为早期乳腺癌的患者在接受治疗后,30%的患者最终会出现复发转移。现在治疗乳腺癌常用的方法主要包括放、化疗及手术治疗,然而女性乳腺癌患者会因手术治疗存在创伤面大、复发率高等缺点而选择化疗,大部分的患者经过长期化疗之后会出现耐药现象,这会减弱化疗药物在机体内的细胞毒性,促进乳腺癌细胞存活与转移,最终严重影响乳腺癌患者的生活质量及疾病预后。因此,为了更好地了解乳腺癌的发病机制,科学家们正在探究各种新型的诊断和治疗的策略,例如靶向治疗和激素治疗,这将会大大地提高乳腺癌的治愈率。Sorafenib是目前临床上常用的化疗药物之一,具有抗肿瘤细胞增殖和抗血管生成的双重作用,它已被批准用于肝癌、肾癌等肿瘤的临床治疗中,可以显著延长患者的总生存时间。它作为多靶点激酶抑制剂之一,能够通过对RAF激酶活性进行有效阻滞,而使RAF/MEK/ERK信号通路中断,从而达到促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞体内增殖和血管生成的效果。AKT/m TOR信号通路可以在必要的机体生理功能中起关键作用,例如细胞代谢,细胞生长,细胞增殖,细胞凋亡和血管生成等,目前已有研究表明肿瘤的Sorafenib耐药与AKT/m TOR信号通路的激活具有正相关。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是由癌细胞和多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成,其中基质细胞包括成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、骨髓源性炎性细胞等,它们会在肿瘤微环境中通过各种方式调控肿瘤的发生发展。肿瘤微环境与肿瘤中血管生成的过程有着密不可分的联系。丰富的血管在肿瘤的生长过程中必不可少,它可以为肿瘤细胞的增殖提供必要的营养和氧气。在肿瘤的血管生成中血管内皮生长因子（VEGF）起到关键作用,它是血管生成主要的调控因子,是血管发育的中央调节剂。VEGF家族包括五个分泌蛋白（VEGF-A,B,C和D和胎盘生长因子PLGF）,VEGF-A通过与血管内皮生长因子受体1和2（VEGFR-1和VEGFR-2）以及它们的共受体NRP-1和NRP-2相互作用来介导其促血管生成作用。VEGF-B诱导血管生成的能力很弱,它起到维持机体生存的作用,而不是促血管生成的作用。VEGF-C和VEGF-D通过与VEGFR-3结合优先介导淋巴管生成,而不是血管生成。因此,血管生成的过程高度依赖于VEGF-A介导的信号转导通路。VEGF-A在几乎所有恶性肿瘤中广泛表达,被公认为是最重要的肿瘤血管生成因子。趋化因子是一类分子量约为8-12 KDa的小分子分泌肽。当机体受到感染或组织损伤后,会引发宿主的防御反应,它被认为是炎症反应期间募集白细胞的主要驱动力。根据氨基末端附近两个半胱氨酸残基的排列,趋化因子可分为四个亚家族（CC、CXC、CX3C和XC）。趋化因子可以趋化免疫系统的各种细胞并参与将这些非恶性细胞募集到肿瘤部位。CXCL12是CXC亚家族成员之一,它的活性在体内多种生理功能是必要的,例如胚胎发生和血管发生,控制造血细胞贩运,粘附,免疫监测和发育。CXCL12对多器官和组织的影响通过与跨膜G蛋白偶联受体CXCR4和CXCR7特异性结合发生相互作用,独立或共同调节细胞的各种功能。由此可见,CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴应该是对于乳腺癌的发病机制以及治疗策略一个不错的切入点。本课题致力于Sorafenib联合CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴对乳腺癌细胞血管生成方面的影响及调控机制的研究,探索新的乳腺癌治疗策略。首先我们通过Western Blot实验发现,在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231两种细胞系中,Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7使CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白表达降低,证明Sorafenib可以影响CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴的表达。通过CCK8细胞增殖检测,我们将Sorafenib作用乳腺癌细胞系中,发现两种细胞系的增殖能力均呈现下降趋势,说明Sorafenib显著抑制了乳腺癌细胞的增殖。随后我们通过Western Blot实验、流式细胞术分析了Sorafenib和CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231两种细胞系增殖的影响,Western Blot结果显示在两种细胞系中,Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7使Ki67和PCNA蛋白表达降低,利用流式细胞术测定细胞周期,发现Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7与对照组比较,细胞周期阻滞于G0/G1期,说明Sorafenib联合CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴干扰了乳腺癌细胞的增殖能力。接着我们通过Western Blot实验和Hoechst染色分析了Sorafenib和CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231两种细胞系凋亡的影响,Western Blot结果显示在两种细胞系中,Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7使caspase3、Bax和Bcl2蛋白表达降低,利用Hoechst 33258染色后,发现Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7较对照组相比较细胞发生了大范围的凋亡,说明Sorafenib联合CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴促进了乳腺癌细胞的凋亡能力。之后我们通过Western Blot实验、酶联免疫吸附实验和HUVEC成管实验分析了Sorafenib和CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231两种细胞系血管生成的影响,Western Blot结果显示在两种细胞系中,Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7使CD31和VEGFA蛋白表达降低,同时我们应用ELISA实验测定细胞上清中VEGFA的含量,结果显示Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7与对照组相比VEGFA表达降低。我们将乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）分别转染CXCR4或CXCR7干扰序列并与Sorafenib共同作用48 h,收集条件培养基,与HUVEC细胞共培养48 h进行成管实验,结果显示Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7条件培养基较对照组的条件培养基显著降低了HUVEC细胞的管腔形成能力,说明Sorafenib联合CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴干扰了乳腺癌细胞的血管生成能力。最后我们通过Western Blot实验分析了Sorafenib和CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231两种细胞系下游通路的影响,结果显示在两种细胞系中,Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7使p-AKT和p-m TOR蛋白表达最低,此外我们使用PI3K/m TOR抑制剂PF-04691502作用两种细胞系,Western Blot结果显示Sorafenib联合下调CXCR4或CXCR7并给予通路抑制剂使p-AKT和p-m TOR蛋白表达降低,进一步证明了Sorafenib对CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴的调节作用是通过AKT/m TOR信号通路调节的。综上所述,我们的实验结果表明Sorafenib靶向CXCL12-CXCR4/CXCR7信号轴调控AKT/m TOR信号通路抑制乳腺癌血管生成。本课题的研究将初步阐明乳腺癌血管生成的机制,为寻求乳腺癌新的靶向治疗策略提供参考依据。