论文部分内容阅读
第一部分AS-IV、IL-1β作用浓度、时间及YAP1-si RNA靶序列筛选目的:观察不同浓度的白介素-1β（Interleukin-1β）对大鼠软骨细胞的细胞活力及黄芪甲苷（Astragaloside IV,AS-IV）对IL-1β诱导的炎性损伤软骨细胞细胞活力的影响,筛选IL-1β及AS-IV的适宜作用浓度和时间;观察不同靶序列si RNA对YAP1的敲降效果,筛选最佳敲降序列。方法:从SD乳鼠膝关节中提取原代软骨细胞并行Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定软骨细胞;设置空白对照组和IL-1β浓度梯度（1、5、10、20、50、100ng/m L）对软骨细胞进行干预,分别于干预12h、24h、48h行MTT法检测细胞活力筛选适宜作用浓度及时间。设置空白对照组、模型组、AS-IV浓度梯度组（50、100、200μmol/L）对软骨细胞进行干预,分别于干预12h、24h、48h行MTT法检测细胞活力筛选适宜作用浓度及时间;设置空白对照组、空载转染组、YAP1-si RNA组（3个不同靶序列）对软骨细胞进行转染,行RT-q PCR检测YAP1 m RNA的表达。结果:免疫荧光结果表明所分离细胞为软骨细胞;MTT结果显示,在一定浓度范围和作用时间内,IL-1β对软骨细胞的损伤作用与作用浓度和作用时间呈正相关;在一定浓度范围和作用时间内,AS-IV对软骨细胞的保护作用与作用浓度和作用时间呈正相关;RT-q PCR结果显示YAP1-si RNA1、YAP1-si RNA2、YAP1-si RNA3作用于软骨细胞后YAP1 m RNA表达均降低,其中YAP1-si RNA2敲降效率最高。结论:IL-1β作用浓度分别为100ng/m L,作用时间为48h;AS-IV作用浓度为200μmol/L,作用时间为48h;YAP1-si RNA2为最佳敲降序列。第二部分黄芪甲苷通过Hippo-YAP通路对软骨细胞炎性损伤的保护作用研究目的:探讨AS-IV对IL-1β诱导的软骨细胞炎性损伤的保护作用,并进一步探究Hippo-YAP通路是否参与到该作用中及其潜在的作用机制,为AS-IV临床治疗OA的软骨损伤提供实验依据。方法:通过IL-1β诱导软骨细胞损伤,构建软骨细胞炎性损伤模型,模拟OA中软骨损伤的病理变化,并分成空白组（Blank,常规培养）、模型组（Model,100ng/m L IL-1β）、AS-IV组（AS-IV,100ng/m L IL-1β+200μmol/L AS-IV）、YAP1敲降对照组（100ng/m L IL-1β+200μmol/L AS-IV+NC-si RNA）以及YAP1-si RNA+AS-IV组（100ng/m L IL-1β+200μmol/L AS-IV+YAP1-si RNA）进行研究。分组处理后,经MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-q PCR检测YAP1、TEAD1、MMP1、TIMP1 m RNA表达情况,Western Blot检测CollagenⅡ、MMP1、TIMP1、TEAD1、p-YAP1、YAP1蛋白的表达情况。结果:MTT法筛选当100ng/mL IL-1β干预软骨细胞48h时,可得到软骨细胞炎性损伤模型;而为200μmol/L AS-IV干预为48h时,能明显改善损伤情况。RT-q PCR、WB检测发现IL-1β作用于软骨细胞后,细胞活性、Ⅱ型胶原含量显著降低,凋亡率、MMP1、TIMP1水平显著上升,表明IL-1β成功诱导软骨细胞的炎性损伤;此外,YAP1 m RNA表达和p-YAP1蛋白表达降低,YAP1蛋白表达上调;加入AS-IV后,细胞活力、Ⅱ型胶原、YAP1 m RNA、YAP1蛋白及其磷酸化产物p-YAP1表达上调,MMP1、TIMP1表达下调;进一步敲降YAP1表达,Ⅱ型胶原、TEAD1 m RNA及其蛋白、YAP1 m RNA、p-YAP1蛋白表达显著下调,YAP1蛋白水平相对稳定。结论:AS-IV对IL-1β诱导的软骨细胞炎性损伤存在保护作用,且Hippo-YAP通路也参与到AS-IV保护炎性损伤软骨细胞的过程中。研究还表明YAP1低表达的情况下,细胞倾向于维持YAP1的去磷酸化水平,以抵抗外界环境的损伤作用。