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研究目的: 采用种子生长法制备稳定、均一的金纳米棒溶液(GNRs),用 PSA和BPVCAM-1对其进行表面修饰,同时负载核酸类药物 NF-κB-decoy ODNs,考察BPVCAM-1靶向的金纳米棒热疗联合基因治疗类风湿性关节炎的体内外效果。 研究方法: (1)采用种子生长法制备金纳米棒,三步离心的方法分离纯化。紫外分光光度计(UV)扫描 GNRs的紫外特征吸收峰;电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-AES)测定GNRs的浓度;激光纳米粒度分析仪测定GNRs的粒径(Size)和电位(Zeta);透射电子显微镜(TEM)观察GNRs的形貌。 (2)金纳米棒表面带有正电荷,在静电吸附作用下负载带有负电荷的基因药物NF-κB-decoy ODNs和安全的亲水性多糖聚唾液酸(PSA);在金-硫键的作用下将具有靶向作用的血管内皮粘附因子-1(BPVCAM-1)的亲和多肽修饰于金纳米棒的表面,构建出 PSA&BPVCAM-1修饰的 GNRs-ODNs的纳米给药系统。二喹啉甲酸法(BCA)测定靶头VCAM-1亲和多肽的载体结合率;红外光谱仪(FTIR)对纳米载体进行定性表征;用琼脂糖凝胶电泳仪对GNRs、ODN、PSA、BPVCAM-1之间用量的摩尔比例进行确定。 (3) CCK-8比色法考察各载体材料和给药系统对Ges-1细胞、RAW264.7细胞和HUVEC细胞的抑制率;流式细胞仪对细胞摄取进行定量分析;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对细胞摄取进行定性分析;采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6细胞炎症因子含量;采用完全弗氏佐剂(10 mg/ml)尾根部皮下注射小鼠建立AIA炎症模型;采用活体成像仪考察载体在小鼠的体内分布情况;采用病理组织切片考察GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1在体内炎症部位的抗炎作用。 研究结果:本课题制备的GNRs紫外特征吸收峰分别为520nm和806nm,长径比大致为4;粒径Size和电位Zeta分别为39.5±2.03nm和23.0±1.36mV;测定的GNRs浓度为1.76nM,透射电子显微镜呈现GNRs为圆柱形,且形状大小均一。经过对GNRs修饰成功制备了 GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1纳米给药系统,并对其进行一系列表征:粒径大小为47.5±5.21nm,电位-23.5±1.52mV,物质的量关系为GNRs:ODN:PSA:VCAM-1=0.125 nM:150 nM:5μM:3μM,紫外吸收光谱未发生明显变化,透射电子显微镜观察到其表面有一层修饰物,能长期保存;细胞毒性实验表明本纳米给药系统无细胞毒性,并能够快速被RAW264.7细胞和 HUVEC细胞摄取; HUVEC细胞迁移实验中, GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser组与各实验组相比,能更好地抑制细胞迁移;体内外抗炎实验中,GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser组与Untreated组及其他实验组相比,有明显的抗炎优势;组织切片实验表明, GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1+Laser组滑膜细胞增生明显减弱,纤维排列整齐,关节腔内几乎无炎症细胞,软骨恢复正常,说明BPVCAM-1靶向的金纳米棒给药系统,能够发挥核酸药物ODNs、GNRs和热疗的协同抗炎效果。 结论:本实验成功构建的 GNRs-ODN-PSA-BPVCAM-1靶向纳米给药系统是一种安全有效的制剂,能够发挥核酸药物 ODNs、GNRs和热疗的协同抗炎效果,在体内外均有良好的抗炎活性,为类风湿性关节炎的治疗提供了新思路。