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目的通过幽门螺杆菌(H.pylori)cagA基因敲除、细胞共培养实验及重组质粒转染细胞实验,探讨H.pylori CagA蛋白对胃癌上皮细胞丝氨酸/苏氨酸激酶PIM2表达的影响,为H.pylori致病机制和胃癌诊疗研究提供基础。方法1.H.pylori cagA 基因敲除菌株的构建:(1)PCR扩增H.pylori NCTC11637菌株cagA基因上下游同源臂片段和质粒pNZ8110氯霉素抗性基因片段,应用无缝克隆技术将这些片段插入质粒pBluescript Ⅱ SK(-)构建cagA基因打靶载体,用PCR、酶切和测序法鉴;重组质粒;(2)通过电转化将打靶载体转入NCTC111637,运用含氯霉素培养板筛选阳性转化菌株,经PCR、基因测序和Western blot检测鉴定cagA基因敲除菌株NCTC11637△cagA。2.H.pylori与胃癌细胞共培养实验:(1)将H.pylori NCTC11637分别与胃癌上皮细胞HGC27、SGC7901和AGS共培养实验,检测当感染复数(Multiplicity of infection,MOI),即细菌数:细胞数,分别为50:1、100:1和150:1时,培养24 h的细胞中PIM2mRNA的表达水平;(2)以MOI为150:1,将NCTC11637分别与HGC27、SGC7901和AGS细胞共培养,检测培养6 h、12 h和24h的细胞PIM2 mRNA 表达水平。(3)分别用 NCTC11637 和 NCTC11637 △cagA以MOI为150:1与胃癌细胞HGC27、SGC7901和AGS共培养,检测感染24 h的细胞中PIM2mRNA的表达。3.H.pylori cagA基因真核表达载体的构建和细胞转染:(1)从NCTC11637菌株基因组DNA中,经PCR扩增获取cagA基因;采用质粒载体pcDNA3.1(+)和无缝克隆技术,构建cagA基因的真核表达载体pcDNA-cagA;(2)实验组以pcDNA-cagA分别转染HGC27、SGC7901和AGS细胞,对照组采用空载体pcDNA3.1(+)转染细胞;(3)应用qPCR方法,在转染后48 h检测细胞PIM2 mRNA表达。结果1.H.pylorAi cag基因敲除菌株的鉴定结果:经PCR和Western blot鉴定,H.pylori cagA基因缺失菌株NCTC11637ΔcagA构建成功。2.H.pylori与胃癌细胞共培养,细胞中PIM2 mRNA的检测结果:(1)采用不同MOI,将H.pylori与胃癌细胞共培养24 h:①H.pylori NCTC11637与胃癌细胞HGC27共培养,当MOI分别为100:1(P=0.001)和150:1(P<0.001)时,实验组PIM2 mRNA表达均较对照组显著上调。②NCTC11637与胃癌细胞SGC7901共培养时,采用不同MOI的3个实验组细胞PIM2 mRNA表达均显著高于对照组(P<0.001)。③NCTC11637与胃癌细胞AGS共培养时,MOI为150:1时细胞PIM2的表达量高于对照组(P<0.001)。(2)以MOI为150:1,将H.pylori与胃癌细胞共培养不同时间的检测结果:①NCTC11637与HGC27细胞共培养12 h和24 h的细胞PIM2 mRNA表达上调(P<0.01)。②NCTC11637与SGC7901细胞共培养6h、12h、24h的细胞PIM2 mRNA表达上调(P<0.05)。③NCTC11637与AGS细胞共培养6h、12 h和24 h的PIM2 mRNA表达均高于对照组(P<0.001)。(3)以 MOI 为 150:1,将 NCTC11637 和 NCTC11637ΔcagA 与 HGC27、SGC7901 和 AGS 细胞共培养 24 h:NCTC11637 和 NCTC11637 ΔcagA感染组细胞PIM2 mRNA表达量均高于对照组(P<0.01),且NCTC11637感染组细胞PIM2 mRNA 高于 NCTC11637ΔcagA 感染组(P<0.001)。3.NCTC11637 cagA真核表达载体的构建与细胞转染:(1)经PCR和测序鉴定证实真核表达质粒pcDNA-cagA构建成功;(2)用pcDNA-cagA分别转染HGC27、SGC7901和AGS细胞,采用qPCR和Western blot法均检测到cagA基因表达,证实pcDNA-cagA转染细胞成功;(3)HGC27、SGC7901和AGS细胞在转染后48 h的PIM2 mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论1.H.pyloricagA基因阳性和敲除菌株均可显著上调胃癌上皮细胞PIM2的表达;H.pylori感染量及感染持续时间影响胃癌细胞PIM2表达水平。2.H.pyloricagA基因具有上调胃癌上皮细胞PIM2表达的作用。3.H.pylori cagA基因转染胃癌细胞上调PIM2的表达,进一步证实H.pylori cagA基因及其表达蛋白对胃癌上皮细胞PIM2表达的调节作用。鉴于PIM2基因是一种原癌基因,研究提示cagA基因调控PIM2表达可能是H.pylori感染致病的重要机制。