脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病,对其医疗投入日益增加、但发病率、死亡率和致残率却居高不下。新的药物和新的治疗手段在不断产生,但其治疗效果却不尽人意。在这些药物中神经保护剂是研究的热点。神经保护剂的种类很多,对其神经保护效果和可能机制的研究有重要的理论意义和实际意义。组织和器官的生存依赖于充足的血液供应,带来营养,带走代谢产物。任何组织的缺血只要达到一定的时间和程度,就会引起组织细胞的损伤。所以一直以来在神经科对于脑缺血其治疗都是在时间窗内积极溶栓,时间窗外恢复脑血供。但随着研究的深入,人们发现,再灌注并不一定使缺血损伤的细胞得到恢复,在一定条件下反而加重了损伤,使可逆性损伤转为不可逆性损伤。因此逐渐提出了缺血—再灌注损伤的概念,即缺血组织恢复血液灌注后反而因起损伤加重的现象。这一现象已得到充分的实验证明和理论依据。因而在缺血性脑卒中的治疗中,单纯恢复灌流是不够的,必须给与神经保护的药物以防止再灌注损伤。在再灌注损伤中,凋亡是一种重要的损伤形式。因此有效的抗凋亡治疗可以保护神经元。但是临床上目前还没有一种明确的药物应用于神经细胞缺血再灌注损伤后的抗凋亡治疗。本实验试图通过应用类缺血再灌注的方法造成原代培养神经元的损伤,模拟机体的再灌注损伤。进一步验证神经保护药物--神经节苷脂对神经细胞的保护作用。并通过对损伤神经细胞的凋亡检测,以期证明神经节苷脂GM-1的这种保护作用是可能通过其抗凋亡作用实现的。为进一步在临床的应用提供有益的探索。目的:建立原代培养神经元类缺血再灌注模型;并通过对单纯类缺血再灌注处理组和加用神经节苷脂GM-1组的比较,观察类缺血再灌注对大鼠皮质神经元细胞损伤的影响及神经节苷脂GM-1对受损神经细胞的保护作用。方法:1、原代神经元的培养:取新生1d—3d的Wistar大鼠,在无菌条件下分离双侧皮质并剥离脑膜,将脑组织剪碎后用胰酶消化,终止消化后过滤,离心,调整细胞浓度,用0.4%的台盼蓝染色计数活细胞数,将细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基种植于培养板或玻片上。然后置于37°C、5%CO2的培养箱中培养,48h加阿糖胞苷以抑制非神经元过度增殖,以后每三天半量换液。倒置显微镜观察神经元形态,并采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定。2、类缺血再灌注模型的建立:用体外培养7d的大鼠皮质神经元细胞,随机分为正常对照组、类缺血再灌注组(缺血组)、类缺血再灌注加GM-1组(实验组)。正常组正常条件培养,缺血组在神经元细胞正常培养7d时将实验条件换为氮气替代空气,同时用无血清的DMEM培养30min,然后转入正常条件下继续培养1 h、6h、12h、24h分别取出细胞进行实验;实验组在缺血前24h加入10μmol/L的GM1作用24h,然后