sEH对db/db小鼠血脑屏障和认知功能的影响及机制研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:xuruiqi8627361
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目的1.研究2型糖尿病模型db/db小鼠血脑屏障及认知功能的改变。2.探索sEH参与调节db/db小鼠血脑屏障及认知功能损伤的作用及可能机制。3.探讨sEH底物14,15-EET对高糖培养下脑微血管内皮细胞的影响及AMPK/HO-1信号通路在其中的调节机制。方法1.将小鼠分为正常对照(NC)组、db/db组和db/db+sEHi组。16周开始,db/db+sEHi组小鼠连续4周在饮用水中给予2mg/L剂量的sEH选择性抑制剂t-AUCB(约0.6-0.8μg/kg体重);NC组和db/db组小鼠分别给予溶剂治疗;体外高糖下培养小鼠脑微血管内皮细胞(BMECs),分别加入14,15-EET,AMPK和HO-1的抑制剂处理后进行观察、检测。2.采用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆功能、Evens-Blue染色检测血脑屏障通透性及透射电镜观察小鼠脑皮质区血脑屏障结构。3.采用免疫荧光及Western-blot检测脑微血管内皮细胞连接/粘附蛋白及sEH、AMPK/HO-1的表达变化。4.采用ELISA法检测脑组织14,15-EET和14,15-DHET的含量变化;采用DCFH-DA分析法检测脑组织切片及脑微血管内皮细胞的ROS水平。结果1.db/db小鼠较对照组认知功能明显减退,sEH抑制剂t-AUCB处理可改善db/db小鼠的认知功能;db/db小鼠的血糖水平和体质量明显高于NC小鼠(p<0.01)。t-AUCB能显著降低db/db小鼠的血糖水平(p<0.05),但对小鼠体重无明显影响。2.db/db小鼠BBB渗出的Evans蓝染料比NC小鼠明显增多(p<0.01)。t-AUCB治疗组与未治疗的db/db小鼠相比,BBB对Evans蓝渗漏显著减少(p<0.05)。此外,在透射电镜下观察到皮质区BBB紧密连接的超微结构。在NC小鼠中为电子致密的相邻内皮细胞之间的紧密拉链状;db/db小鼠紧密连接的电子密度降低,伴随着细胞连接间隙的形成且紧密连接伸入微血管腔形成鱼嘴状结构。t-AUCB治疗组,内皮细胞间隙随着深色拉链样紧密连接的重新出现呈闭合状态。3.免疫荧光及Western blot检测提示,db/db小鼠与NC小鼠相比,ZO-1和VE-cadherin蛋白表达水平均显著降低(p<0.01)。sEH抑制剂t-AUCB治疗能显著改善ZO-1和VE-cadherin蛋白的表达(p<0.01,p<0.05)。4.db/db小鼠脑组织sEH蛋白水平较NC小鼠升高(p<0.05)。t-AUCB治疗能显著抑制db/db小鼠脑组织sEH表达(p<0.01)。小鼠脑组织ROS水平的变化与sEH呈相同趋势。糖尿病小鼠14,15-EET水平较NC小鼠下降(p<0.01),而t-AUCB治疗可显著上调14,15-EET含量(p<0.05)。db/db小鼠脑组织的p-AMPK和HO-1蛋白表达较NC小鼠降低(p<0.01),sEH抑制后可明显上调p-AMPK和HO-1表达(p<0.01)。5.BMECs的Western-blot检测及免疫荧光染色结果显示,与正常糖(NG)组相比,高糖(HG)组脑微血管内皮细胞,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和粘附蛋白VE-cadherin的表达明显降低。HG组较NG组BMECs的ROS水平明显升高(p<0.01)。经14,15-EET处理后可减少紧密连接/粘附蛋白的丢失及降低ROS水平(p<0.01);抑制AMPK和HO-1可阻断14,15-EET对高糖下BMECs的上述保护作用(p<0.01)。结论1.db/db小鼠脑sEH的表达上调;抑制sEH能保护db/db小鼠的认知功能及血脑屏障的通透性和结构完整。2.sEH抑制剂t-AUCB能上调db/db小鼠脑内14,15-EET含量、活化AMPK/HO-1及减少氧化应激。3.14,15-EET可能通过AMPK/HO-1途径抑制高糖诱导的BMECs氧化应激和连接/粘附蛋白丢失。
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