随着抗菌药物的大量使用，近年来革兰阴性杆菌在临床的分离率和耐药率呈逐年上升趋势，其中，以铜绿假单胞菌为代表的革兰阴性杆菌的耐药现状尤为突出。喹诺酮类药物通过抑制细菌Ⅱ类拓扑异构酶，阻断DNA的复制而产生抗菌作用，以其抗菌谱广，对革兰阴性杆菌活性强，在体内分布广，组织分布浓度高，无交叉耐药性等优点，逐渐成为临床治疗铜绿假单胞菌感染的重要抗菌药物。但随着多重耐药和泛耐药菌株的出现，铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性日趋严重，铜绿假单胞菌感染的发病率和病死率迅速上升，研究铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药的分子机制势在必行。　　 本实验回顾性分析了我院2002-2010年针对铜绿假单胞菌感染，抗菌药物的消耗量，铜绿假单胞菌的分布，耐药性变迁以及耐药率和常用抗菌药物用量之间的关系；收集我院铜绿假单胞菌82株，分别用纸片扩散法和琼脂稀释法测定其敏感性，并从中筛选出同时对氟喹诺酮类药物耐药的38株铜绿假单胞菌，PCR扩增其Ⅱ型拓扑异构酶基因，纯化，测序，并对测序结果进行比对和统计学检验，分析Ⅱ型拓扑异构酶基因突变和耐药性的关系；通过实时荧光定量PCR分析4种外排系统MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM中膜连接蛋白MexA、MexC、MexE和MexX基因的表达量及其在耐药菌株中的分布，从分子水平说明我院铜绿假单胞菌耐药的原因。　　 一、我院铜绿假单胞菌耐药与抗菌药物的使用的相关性研究　　 回顾性分析我院2002-2010年铜绿假单胞菌的分布，以呼吸道感染居多，伤口感染次之，尿路感染最少；分析我院抗菌药物的使用频率，从2007年，喹诺酮类药物成为使用频率最大的抗菌药物；铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药率除氨基糖苷类，各类抗菌药物均呈上升趋势；抗菌药物的使用量与铜绿假单胞菌耐药率相关性研究表明喹诺酮类药物（环丙沙星、左氧氟沙星）和碳青霉烯类药物（亚胺培南、美罗培南）的使用与铜绿假单胞菌耐药率的增加，存在相关性。　　 二、铜绿假单胞菌临床分离株敏感性及其对氟喹诺酮类药物耐药的分子机制的研究　　 收集临床分离非重复铜绿假单胞菌82株，测定其对5种氟喹诺酮类药物环丙沙星，左氧氟沙星，氧氟沙星，诺氟沙星，莫西沙星的耐药率，结果依次48.8％，61.2％，61.0％,46.2％，96.3％。我院铜绿假单胞菌对氟喹诺酮药物的耐药性较严重。　　 从所收集的82株临床非重复铜绿假单胞菌中，筛选出38株同时对氟喹诺酮类药物环丙沙星，左氧氟沙星，诺氟沙星耐药的铜绿假单胞菌，26株存在gyrA基因Thr83(ACC)→Ile(ATC)突变，未发现存在parC亚单位Ser80(TCG)→Leu(TTG)突变的菌株，及gyrB基因、parE基因突变株。发现4个分离株的parC亚单位在同一位置存在碱基A的缺失，进而导致相应氨基酸的错译。　　 gyrA基因突变组与未突变组对环丙沙星，左氧氟沙星的敏感性有显著性差异(P＜0.05)，而对诺氟沙星的敏感性gyrA突变组与未突变组间没有显著性差异(P＞0.05)。　　 通过比较在加入和不加外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(PAβN)2种处理条件下测得的MIC，对38株同时对氟喹诺酮类药物环丙沙星，左氧氟沙星，诺氟沙星耐药的铜绿假单胞菌进行外排泵超表达阳性表型的筛选，外排泵超表达表型阳性率为23.7％(9/38)。　　 以铜绿假单胞菌中构成4种外排系统MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM的4种膜连接蛋白基因mexA，mexC，mexE，mexX为目标扩增基因，以保守的管家基因(housekeepinggene)rpsL为参比基因，通过设计合成目标基因mexA，mexC，mexE，mexX和参比基因rpsL的引物，经实时荧光定量PCR扩增后，外排基因mexA超表达的菌株有6株，其超表达率为15.8％(6/38)；外排基因mexE超表达的菌株有3株，其超表达率为7.9％(3/38)。在本次试验中未发现外排基因mexC和mexX超表达的菌株。　　 通过对我院近9年分离的铜绿假单胞菌耐药现状的研究，我院铜绿假单胞菌感染以呼吸道感染为主。定期监测本地区铜绿假单胞菌耐药率变化，对于临床治疗铜绿假单胞菌引起的感染具有现实意义。　　 我院铜绿假单胞菌耐药是由gyrA基因Thr83(ACC)→Ile(ATC)突变和MexAB-OprM，MexEF-OprN外排系统mexA和mexE基因超表达，这两种机制介导的。