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麻黄碱(Ephedrine),由于具有较大的药理作用,广泛应用于临床医疗中。利用生物转化法制备光学纯的麻黄碱具有反应条件温和,立体选择性较高等优点,是生产麻黄碱的理想途径之一,具有较大发展潜力;但是该生物转化过程中需要辅酶来提供还原力。本论文着眼于本研究室前期遇到的生物转化过程中辅酶再生的问题,以自身含有葡萄糖脱氢酶GDH的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主,构建羰基还原酶基因mldh游离表达菌株及整合型表达菌株,以实现mldh在枯草芽孢杆菌中的表达并通过细胞内的GDH完成辅酶的再生。本文以B. subtilis Wb600为宿主,枯草芽孢杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连同表达元件一起连接至枯草芽孢杆菌载体pHY300plk上得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将该重组质粒转化入B. subtilis Wb600中获得游离表达菌株B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh -TrpsD)。对此游离表达菌株进行全细胞生物转化反应实验发现,在葡萄糖存在的情况下,其可转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(简称MAK)生成d-伪麻黄碱;0.2 g培养时间为12 h的游离表达菌株湿菌体,加入0.4 mg的MAK和18 mg的葡萄糖转化反应,产量最高达97.5 mg/L,底物摩尔转化率为24.1%。之后以枯草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因amyE为整合位点,pUB110上kan为抗性标记基因;构建kan两端含有loxp位点的整合表达载体pUC19-5E-pmt-loxpkan-3E;将该载体转化入B. subtilis Wb600中获得菌株B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxpkan-3E)。再以质粒pSH47为模板扩增CRE重组酶基因cre,枯草芽孢杆菌PxylR基因为启动子,构建表达质粒pHY300plk-PxylR-cre-trpsD ;将该载体转化入B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxpkan-3E),木糖诱导cre基因表达,敲除抗性基因kan;再通过传代培养丢失质粒pHY300plk-PxylR-cre-trpsD,最终得到整合型表达菌株B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxp-3E)。对该整合型重组菌B. subtilis Wb600 (5E-pmt-loxp-3E)进行全细胞转化反应实验,结果0.2 g培养时间为12 h的整合型重组菌湿菌体,加入0.3 mg的MAK和6 mg的葡萄糖转化反应,d-伪麻黄碱产量为47.2 mg/L,底物摩尔转化率为15.5%。本研究成功将外源基因mldh整合到枯草芽孢杆菌染色体上,实现了目的基因在宿主菌中的稳定表达,并完成辅酶的再生。研究结果为利用重组B. subtilis生物转化生产d-伪麻黄碱进行了有益探索。