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研究背景:支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早产儿常见肺部疾病。常规治疗对肺长期发育疗效有限,急需新型治疗方法。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs可）以提高急性肺损伤大鼠存活率,多个临床实验也表明MSCs能减轻BPD患者肺纤维化,但机制尚不清楚。人羊膜间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs）具有增殖快、纯度高和免疫原性低等特点,具有很好的免疫调控作用。我们通过气管注入hAD-MSCs及其衍生条件培养液（conditioned medium,CM）和外泌体（exosomes,EXOs）治疗高氧诱导肺损伤的新生大鼠BPD模型,并进一步探索它们的分子治疗机制。研究目的:培养hAD-MSCs并鉴定;获取hAD-MSC-EXOs和hAD-MSC-CM并研究其基本特性。对比分析气管注入hAD-MSCs、hAD-MSC-EXOs及hAD-MSC-CM治疗高氧诱导肺损伤新生鼠的疗效和机制。研究方法:1.hAD-MSCs、hAD-MSC-CM和hAD-MSC-EXOs的分离鉴定:（1）羊膜经酶消化后贴壁培养,流式细胞术鉴定表型并通过诱导培养鉴定hAD-MSCs的多向分化能力。（2）当细胞达到80%融合时收集上清离心获得hAD-MSC-CM;或细胞血清饥饿后收集上清超高速离心获得hAD-MSC-EXOs。透射电镜观察hAD-MSC-EXOs超微形态。蛋白印迹法鉴定CD63、CD9、CD81及热休克蛋白70在外泌体上的表达。2.气管注入hAD-MSCs、hAD-MSC-CM及hAD-MSC-EXOs治疗高氧诱导新生大鼠肺损伤:（1）新生大鼠分为:实验组:常氧对照组（常氧组）、高氧模型组（高氧组）、高氧模型气管注入hAD-MSCs治疗组（hAD-MSCs组）、高氧模型气管注入hAD-MSC-CM治疗组（hAD-MSC-CM组）和高氧模型气管注入hAD-MSC-EXOs治疗组（hAD-MSC-EXOs组）。高氧组在80%氧气饲养。生后第7天,hAD-MSCs组、hAD-MSC-CM组和hAD-MSC-EXOs组分别气管内注入hAD-MSCs（1×106细胞/50 μL）、hAD-MSC-CM（50 μL）及 hAD-MSC-EXOs（300ng/50μL）。为显示经气管注射后的hAD-MSCs,孵染PKH26进行体内示踪。每天观察大鼠体征并绘制生存曲线。（2）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症因子的水平:收集各组BALF和肺组织样本。ELISA 法检测 BALF 中 TNF-α、IL-6、IL-1β和 MCP-1 浓度。并检测 BALF 中 MDA和SOD。（3）分析肺组织病理学和肺重/体重比:采用病理学5级评分系统分析各组新生大鼠的肺组织损伤程度。使用平均线性截距（mLI）进行标准化分析。（4）微阵列分析信号传导通路及差异表达的基因:提取肺总RNA进行RNA杂交,筛选差异表达基因。采用荧光定量PCR验证微阵列结果中有显著差异表达的基因。使用蛋白印迹法检测差异蛋白表达。3.统计学分析:所有数据均以3个单独实验的平均值±SEM表示。数据分析采用Student t检验进行两组间比较。在P＜0.05时,差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行分析。研究结果:1.hAD-MSCs、hAD-MSC-CM 和 hAD-MSC-EXOs 的获取及生物学特性:（1）hAD-MSCs的培养及鉴定:原代培养的贴壁细胞呈典型的纤维细胞形态,阳性表达MSCs标记物CD90、CD105、CD44、CD29和CD73,阴性表达内皮细胞标志物CD31和造血标志物CD34和CD45。可被诱导为成脂细胞、软骨细胞和成骨细胞。（2）hAD-MSC-EXOs的特征:测定蛋白质的浓度以定量EXOs,平均每100mL培养液可获得150ng EXOs,平均直径为30～150nm。EXOs阳性表达CD9、CD63、CD81和Hsp-70。2.气管注入hAD-MSCs、hAD-MSC-CM和hAD-MSC-EXOs治疗高氧诱导新生大鼠肺损伤的疗效分析:（1）与常氧组相比,高氧组新生大鼠的活动力显著降低且存活率显著降低（P＜0.05）。生后14天hAD-MSCs组存活率显著提高（P＜0.05）,且治疗后的新生大鼠没有进一步的死亡。hAD-MSC-EXOs组和hAD-MSC-CM组生存率较高氧组提高,但无统计学意义（P＞0.05）。hAD-MSCs、hAD-MSC-EXOs和hAD-MSC-CM治疗均不能增加实验组新生大鼠的体重（P＞0.05）,但三组都降低了肺重/体重比（P＜0.05）。荧光活体示踪可见细胞在12h主要集中在肺部,24h后以胸部为中心逐渐弥散到全身,但胸部仍然是干细胞的主要集中区域。（2）高氧组新生大鼠BALF中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平均显著升高（P＜0.05）。与高氧组相比,hAD-MSCs组、hAD-MSC-EXOs组和hAD-MSC-CM组的上述4种炎症因子水平均显著降低（P＜0.05）。BALF中的中性粒细胞数量、MDA浓度和总蛋白也反映出相同的趋势（P＜0.05）。其中,hAD-MSCs组下降幅度最大（P＜0.05）。高氧组BALF中SOD的表达水平显著降低（P＜0.05）。hAD-MSCs和hAD-MSC-EXOs治疗均能显著增加SOD的表达水平（P＜0.05）,而hAD-MSC-CM治疗则不能。（3）与常氧组相比,高氧组新生大鼠肺组织的病理切片可见炎症细胞浸润、肺泡隔增厚及肺实质的结构破坏。高氧组的肺组织损伤5级评分和mLI值显著高于常氧组（P＜0.05）;hAD-MSCs 组、hAD-MSC-EXOs 组和 hAD-MSC-CM 组肺组织损伤 5级评分和mLI值显著降低（P＜0.05）。其中,hAD-MSCs组的肺组织损伤评分优于hAD-MSC-EXOs组和hAD-MSC-CM组（P＜0.05）。（4）高氧损伤后,共4个基因在肺组织中的表达显著降低,有6个基因的表达在高氧损伤后高度上调。这些基因的表达变化都超过3倍,其中氨酰基肽水解酶（acyla minoacyl-peptide hydrolase,APEH）基因的表达水平变化最为显著（P＜0.01）。Western blotting检测APEH蛋白的灰度量化数据显示,高氧损伤后APEH的蛋白表达显著降低（P＜0.05）,hAD-MSCs治疗后APEH表达显著升高（P＜0.01）。研究结论:1.培养的hAD-MSCs具备旺盛增殖能力,并且符合MSCs的细胞表型和多向分化标准。2.建立了血清饥饿法联合超高速离心获得EXOs的技术体系;确定了 hAD-MSC-EXOs的直径范围及表达标志物。3.与hAD-MSC-EXOs和hAD-MSC-CM相比,气管注入hAD-MSCs可以更好的改善高氧诱导新生大鼠的肺组织炎症及肺水肿水平。4.hAD-MSCs治疗前后APEH基因表达变化显著,该基因表达可能与高氧诱导的肺损伤及hAD-MSCs治疗密切相关。