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目的:目前多发性骨髓瘤有效的临床治疗策略包括放化疗、自体/异体干细胞移植和靶向药物治疗等等,近年来尽管以硼替佐米(Bortezomib)和来那度胺(Lenalidomide)等为代表的新药与移植组合方案显著延长了患者生存期,但是几乎所有患者仍然面临疾病进展和耐药。已有诸多文献表明来源于肿瘤细胞产生的微泡在肿瘤的生长,血管新生,免疫逃逸,肿瘤转移及肿瘤耐药等方面均发挥了重要作用。课题组前期研究也显示富含ZNF224蛋白的骨髓瘤细胞来源微泡在体外促进内皮细胞血管新生,血清饥饿应激状态下的骨髓瘤细胞微泡促内皮细胞小管形成能力显著增强。然而这些都是体外实验结果,在体内环境复杂该作用是否会受体内环境及各组分影响发挥相应作用并不清楚,本课题拟建立多发性骨髓瘤荷瘤小鼠模型,在MM荷瘤小鼠模型中研究骨髓瘤细胞来源的微泡对肿瘤生长和血管新生的影响,并探讨其可能的机制。方法:将RPMI8226细胞株接种在NOD/SCID小鼠右上肢外侧,构建多发性骨髓瘤荷瘤小鼠模型。当小鼠移植瘤体积达到300 mm3时将荷瘤小鼠随机分为2组,即对照组和实验组,对照组给予尾静脉注射PBS缓冲液0.5 ml(隔日1次,连续5次),实验组给予尾静脉注射PKH26荧光标记的骨髓瘤细胞来源微泡70 ug(隔日1次,连续5次)。观察记录小鼠的一般生存状况,饮食状况,隔日1次测量移植瘤体积,详细记录并绘制移植瘤体积变化曲线。在d10天颈椎脱臼法处死所有实验小鼠,剥离移植瘤组织,并留取各个器官组织标本。免疫荧光法检测内皮细胞标记物CD31在移植瘤组织的表达,以比较移植瘤肿瘤血管新生差异。将移植瘤组织及不同器官组织制做冰冻切片,应用荧光显微镜观察PKH26荧光染色的骨髓瘤微泡在荷瘤小鼠模型中的分布,通过荧光强度比较微泡在移植瘤及各个脏器组织中的分布差异。应用Western blot方法检测比较骨髓瘤来源微泡干预的移植瘤组织和对照组中NF-κB-pp65的表达。并检测移植瘤组织中NF-κB下游靶基因VEGF的m RNA及蛋白水平变化。结果:1 MVs进入体内的分布情况:在NOD/SCID小鼠右上肢外侧皮下接种3×107 RPMI8226细胞,皮下接种骨髓瘤细胞第20天左右可序贯形成移植瘤。在小鼠移植瘤体积达到300 mm3时开始随机分组进行实验并计为d0天,在d10天时结束所有小鼠的实验观察,处死实验小鼠,剥离移植瘤组织,并留取肝、脾、骨、肾、胃、肠、皮肤、脑等器官组织。在本实验中我们用PKH26荧光染料标记尾静脉注射的骨髓瘤MVs,在荧光显微镜下观察组织切片中MVs分布情况,结果显示肝脏、脾脏荧光强度最高(肝:121.14±42.75、脾:101.63±18.92),其次是移植瘤组织63.63±28.03)及骨髓组织(60.12±12.03)中荧光强度较高,其他器官组织荧光强度较弱。提示其分布有相对选择性。2骨髓来源的MVs注射对多发性骨髓瘤荷瘤小鼠肿瘤增长的影响:肿瘤生长曲线显示尾静脉注射骨髓瘤细胞来源的MVs后,实验组小鼠的肿瘤增殖速度明显高于对照组(P<0.05),提示MVs可能促进移植瘤生长。3进一步观察肿瘤血管新生的变化:采用CD31标记血管内皮,免疫荧光法检测移植瘤组织中CD31的表达,观察两组肿瘤中血管密度是否存在差异,结果发现,实验组移植瘤组织CD31表达为(100.14±1.13)明显高于对照组(88.84±2.7),差异有统计学意义(P<0.01)。提示尾静脉注射骨髓瘤MVs促进了移植瘤的肿瘤血管新生。4应用Western blot方法检测移植瘤组织中NF-κB-pp65和VEGF水平的表达,结果显示实验组移植瘤组织内NF-κB-pp65的表达(2.01±0.06)较对照组(1.40±0.19)显著升高(P<0.01)。相应地,在NF-κB活化的肿瘤组织内,VEGF蛋白质(1.67±0.08)和m RNA水平(1.97±0.11)较对照组VEGF蛋白(0.94±0.03)和m RNA水平(1.04±0.058)升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:在MM荷瘤小鼠模型中,尾静脉注射的骨髓瘤细胞来源的MVs选择性地滞留于肿瘤组织,通过激活NF-κB信号通路促进肿瘤血管新生,进而促进肿瘤生长。