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乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因之一,严重威胁人类的健康。作为一种非细胞毒性嗜肝病毒,HBV可在肝细胞内复制,病毒本身并不造成肝细胞的破坏,但由此引起的免疫应答一方面有利于清除病毒,另一方面也可导致肝脏损伤。传统理论认为CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗HBV感染及其引起的免疫损伤中起主导作用,但是随着肝脏天然免疫系统理论的提出,肝脏中的天然免疫细胞在HBV感染及其免疫致病中发挥的效应引起学者们的高度重视,尤其是NK细胞在HBV感染中的作用越来越受到关注。研究表明NK细胞参与HBV感染后的免疫应答,HBV逃逸NK细胞的清除作用与病毒持续性感染密切相关。同时慢性HBV感染者对于外界因素如化学毒物、酒精、细菌感染等刺激后肝细胞更加容易损伤,影响了肝脏后续的再生能力。本研究通过对HBV DNA复制水平不同的病毒感染者进行分组,探讨NK细胞在HBV感染者免疫应答中的作用,通过流式细胞术分析不同HBV感染状态的病人外周血NK细胞的比例、功能、表面活化性受体和抑制性受体的表达,发现HBVDNA病毒载量增高患者伴随NKG2A+NK细胞比例升高,NKG2A抑制NK细胞抗病毒活性导致HBV持续感染,可能是HBV逃逸NK细胞攻击的原因之一阻断NKG2A有可能成为治疗HBV持续感染的靶点。同时在化学毒物诱导的小鼠模型中观察到肝脏NK细胞对于肝脏损伤后再生的影响,为了解慢性HBV感染者在接触化学毒物后NK细胞对于肝脏的修复能力提供研究基础。主要研究结果分以下两部分：(一)NK细胞高表达NKG2A介导HBV慢性免疫逃逸1.病毒复制限制性CHB病人NK细胞比例增高在病毒复制水平受到限制的CHB病人(HBV DNA< 105 copies/ml)外周血中NK细胞较正常对照组、病毒复制水平较高组和肝硬化病人明显升高,并且与HBVDNA拷贝数和血清ALT呈明显负相关,说明NK细胞减少不利于HBV的清除和病情的缓解。进一步对NK细胞的功能分析发现：IL-12体外刺激病毒复制限制性CHB病人NK细胞后,其分泌IFN-γ的能力要明显高于高病毒复制的CHB病人和正常对照组；NK细胞杀伤试验证明,病毒复制限制性CHB病人与高病毒载量的CHB病人相比,NK细胞表达CD107a、杀伤K562细胞的能力明显增强。2.HBV DNA拷贝数升高患者伴随NKG2A+NK细胞升高对大量HBV病人进行NK细胞活化性受体和抑制性受体检测发现,不同研究对象活化性受体NKG2D, NKG2C, NKp30, NKp44, NKp46,抑制性受体KIR2DL3, KIR3DL1,CD158b,CD158a等均无明显改变,但抑制性受体NKG2A有明显改变,在低拷贝病人中NKG2A的表达较低,在高拷贝病人和肝硬化病人中NKG2A+NK细胞比例明显增高,并且与HBV DNA病毒载量和ALT表达呈正相关关系,说明NKG2A的高表达抑制了NK细胞的活化,不利于HBV清除和病情缓解。3.阻断NKG2A能恢复HBV持续感染者NK细胞功能,甚至清除HBV通过杀伤试验发现,体外阻断NKG2A之后,只有HBV DNA病毒载量高的病人外周血NK细胞对K562细胞的杀伤能力增强,而在正常对照组和低拷贝病人外周血中NK细胞对K562细胞的杀伤能力没有变化。并且在阻断了NKG2A信号之后,纯化的NK细胞对肝细胞系L02、肝癌细胞系HepG2和整合有HBV基因的肝癌细胞系HepG2.2.15的杀伤功能也明显增强。为了证明阻断NKG2A后的体内抗病毒效应,我们通过高压注射HBV质粒建立HBV感染小鼠模型,分别用抗NKG2A抗体和抗NKG2A的配体Qa-1的抗体进行阻断,结果发现HBV感染小鼠血清中HBsAg,HBV DNA均显著降低。提示阻断NKG2A有可能成为治疗HBV持续感染的靶点。(二)NK细胞高分泌TNF-a抑制急性肝脏损伤后再生上述实验结果显示NK细胞对于清除HBV感染有重要作用,但同时NK细胞也可导致部分肝脏损伤,鉴于肝脏损伤均伴随肝脏自身的再生修复,本研究将进一步探讨NK细胞在肝脏再生的作用。我们采用了化学毒物CCl4诱导的肝脏损伤为肝脏再生模型,研究NK细胞的活化对于肝脏再生的影响。结果发现,实验鼠在同时注射了poly I:C和CCl4之后能够明显抑制肝脏再生,用AsGM1清除NK细胞或用NK1.1抗体清除NK1.1+细胞(包含NK细胞和NKT细胞),poly I:C抑制的肝脏再生得到明显恢复,提示NK细胞参与肝脏再生抑制。其机理是poly I:C和CCl4能够诱导肝脏中NK细胞的大量聚集和活化,细胞因子IFN-y和TNF-a的分泌明显增高,并且体内中和TNF-a而不是IFN-y之后肝脏再生功能得到恢复。这些结果表明在CCl4诱导的肝脏损伤模型中poly I:C活化的NK细胞通过分泌TNF-α抑制肝脏再生。综上所述,活化的NK细胞能够抑制体内HBV的复制,但NK细胞表面NKG2A的上调可使其失去抑制HBV的功能；过度活化的NK细胞在肝脏损伤后的修复过程中还可发挥负调节作用。这些结果对于进一步了解HBV逃逸天然免疫攻击、导致慢性持续性感染以及肝炎的防治具有一定的指导意义。